乙醇滴注法制備猴頭菇多糖脂質體

[摘要] 目的 研究乙醇滴注法制備猴頭菇多糖脂質體的最佳處方及制備工藝。 方法 采用乙醇滴注法制備猴頭菇多糖脂質體；以包封率和穩定性參數為考察指標，采用正交設計優化處方與制備工藝，紫外分光光度法測定脂質體包封率。結果 最佳處方為磷脂20 mg/mL，膽固醇用量為2.0 mg/mL，VE用量為2.0 mg/mL，藥液濃度為0.8 mg/mL；最佳制備工藝為水浴溫度60℃，滴注速度越小越好，乳勻時間15 min，磁力攪拌速度40 r/min，按最佳處方及工藝制得的猴頭菇多糖脂質體均勻圓整，包封率69.7%。 結論 乙醇滴注法制備工藝簡單，易于掌握，優選得到的脂質體處方和制備工藝穩定可行。

[關鍵詞] 猴頭菇多糖；脂質體；正交試驗；乙醇注入法

[中圖分類號] R944 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2013）04-51-03

猴頭菌Hericium erinaceus（Bull.Ex Fr.）又名猬菌、刺猬菌、小刺猴頭、猴菇、猴頭菇，隸屬于擔子菌門，齒菌科[1]，是著名的藥食兩用菌。猴頭菇，味甘，性平，歸脾、胃經。猴頭菇多糖是猴頭菌的主要活性成分之一，具有免疫調節、抗腫瘤、抗衰老、降血脂、降血糖、抗突變、防輻射等作用[2]。猴頭菇多糖制成的藥物和保健品深受人們喜愛，開發前景廣闊。但多糖是一種不太穩定的化學物質，進入體內后，會受到各種胃腸酶的攻擊而降解，失去藥效活性，將其制成脂質體制劑后，可以有效地防止胃酸、脂肪酶、胰蛋白酶等對多糖的攻擊；且脂質體作為藥物載體可以提高藥物治療指數，降低藥物毒性[3]。

1 資料與方法

1.1 儀器與試劑

紫外可見分光光度儀GBC Cintra10 （澳大利亞GBC公司），高效液相（美國Waters公司），旋轉蒸發儀（德國Heidolph公司），磁力攪拌器（德國IKA公司），旋渦混合振蕩器（江蘇海門其林醫用儀器廠），恒溫水浴鍋（北京靖衛科學儀器廠）。

猴頭菇多糖（實驗室自制），大豆磷脂（上海太偉藥業有限公司），膽固醇（sigma公司），VE（sigma公司），95%乙醇、乙醚、三氯甲烷均為分析純。

1.2 猴頭菇多糖脂質體制備方法的考察

1.2.1 猴頭菇脂質體的制備[4] 采用乙醇滴注法制備猴頭菇多糖脂質體。將一定量的磷脂和其他輔料溶于一定量的乙醇溶液中，待完全溶解后滴入60℃下的恒溫藥液中，轉速40 r/min，邊滴邊攪拌，滴注速度越小越好，滴注結束后藥液恒溫攪拌10 min，使之形成穩定的脂質體混懸液。室溫下旋轉蒸發除去乙醇，將得到的溶液用蒸餾水定容，于60℃水浴中保溫1 h，冷卻至室溫，用0.45μm的微孔濾膜過濾，灌裝，充氮氣，封口，既得。

1.2.2 含量測定 采用蒽酮-硫酸比色法使用紫外分光光度儀測定猴頭菇多糖含量，檢測波長為（625±1）nm。

1.2.3 包封率（QW）的測定[5] 精密吸取脂質體溶液適量，加少許Nacl和氯仿于10 mL容量瓶中；置50℃水浴3 min，拿出放在旋渦混合振蕩器上振蕩2 min，破乳后加蒸餾水至10 mL，搖勻，4℃放置至上層液澄清，測定藥液含量，計算總藥量W1。另取適量脂質體溶液，上樣于shodex柱，填料為多孔硅膠，以蒸餾水為洗脫液進行洗脫，流速為1 mL/min；檢測波長為280 nm；通過HPLC的工作站可以得到脂質體與游離藥物的分離圖譜直接接取游離藥物量W2。猴頭菇多糖的含量測定用蒽酮-硫酸比色法使用紫外分光光度儀測定。按照公式Qw=（W1-W2）/W1×100%，計算包封率。

1.2.4 穩定性參數（Ke）的測定[6] 精密吸取該脂質體溶液0.2 mL，置于10 mL量瓶中，定容至刻度，另取1 mL，置于離心試管中，以5 000 r/min離心5 min，吸取上層溶液0.2 mL于10 mL量瓶中，定容至刻度，分別測定它們在500 nm處的吸光度值D0、D，按下式計算穩定性參數Ke。Ke=（D0-D）/D0，D-代表離心后上層脂質體吸光度，D0-代表離心前脂質體吸光度。

1.2.5 猴頭菇多糖脂質體處方篩選[7] 在單因素考察試驗結果的基礎上，利用正交試驗法考察磷脂用量（A）、VE用量（B）、膽固醇用量（C）、藥液濃度（D）4個主要因素及其不同水平對猴頭菇多糖脂質體制備的影響，并以Qw和Ke為考察指標篩選最佳處方。本試驗中衡量指標不止一個，因此采用綜合評分法試驗結果進行分析，對于穩定性參數項用（1-Ke）×100%作其分值，在此分值上再加上包封率指作為綜合分數。正交試驗因素水平設計見表1。

1.2.6 制備工藝的優化（表3） 在猴頭菇多糖脂質體的制備過程中，通過改變制備工藝參數考察其對猴頭菇多糖包封率和穩定性參數的影響，即水浴溫度設為50、55、60、65℃4個水平；磷脂液滴注速度為0.5、1.0、1.5、2.0 d/s 4個水平；乳勻時間為8、14、20、26 min 4個水平；磁力攪拌速度分別選擇10、20、30、40 r/min 4個水平。

2 結果

2.1 猴頭菇多糖脂質體制備的處方篩選結果

在脂質體制備的評價指標中，包封率越高、Ke值越小說明該工藝的包合效果越好。在本研究方案所取的因素和水平下以上述兩者的綜合分為評價指標，最后得出最佳生產工藝組合為A3B3C2D2，即磷脂的用量對猴頭菇脂質體的包封率和Ke值有較大影響，藥液的濃度和膽固醇濃度次之，VE濃度影響較小。最終確定處方為磷脂20 mg/mL，膽固醇用量為2.0 mg/mL，VE用量為2.0 mg/mL，藥液濃度為0.8 mg/mL。見表2。

2.2 制備工藝優化的結果

通過實驗，最終確定猴頭菇多糖脂質體的制備工藝為水浴溫度60℃，滴注速度越小越好，乳勻時間15 min，磁力攪拌速度40 r/min。見表3。

2.3 猴頭菇多糖脂質體QW的測定

按照上述實驗得到的最優處方及工藝制備3批猴頭菇多糖脂質體，并按2.3方法測定其QW得平均值為69.7%。

3 討論

目前，脂質體制備方法有注入法、薄膜分散法等[8]。從

藥劑學的角度來考慮，其制備方法應具有工藝簡單、包封率高、穩定性好、易消毒、適合于大規模生產等優點。杏鮑菇多糖極性大是水溶性成分，因此首先考慮用滴注法，該法是獲得脂質體的最簡單方法之一。

脂質體制備過程中，包封率隨水浴溫度的升高而增大，但當溫度超過60℃時，包封率即下降趨勢，可能是因為此時溫度高于了磷脂的相變溫度，使膜厚度減小導致膜內藥物泄露使包封率下降，因此水浴溫度最終選定60℃；當滴注速度過快時可以看到藥液中出現明顯的沉淀現象，因此滴注速度越小越好，不能超過1.5 d/s；脂質體的粒度及分布受到磷脂濃度的影響，通過加大攪拌速度和延長乳勻時間在一定程度上使其優化；然而過度延長乳勻時間QW反而降低，可能由于乳勻時間過長，破壞了部分脂質體，導致包封率降低；磁力攪拌速度越快磷脂溶液在水相中分散的越快，包封率也就越高，但攪拌速度太快容易使藥液濺出，所以選擇了40 r/min的攪拌速度使包封率盡量達到最好的效果。多糖是一種不太穩定的化學物質，進入體內后，會受到各種胃腸酶的攻擊而降解，失去藥效活性，脂質體不但把治療藥物輸送到靶部位，而且保護了其生物活性[9]。因此將猴頭菇多糖制成脂質體具有重要的意義。

[參考文獻]

[1] 國家中醫藥管理局《中華本草》編委會.中華本草[M].上海：上海科學技術出版社，1999：522-524.

[2] 胡斌杰，師兆忠.超聲法提取猴頭菇多糖最佳工藝優化研究[J].化學世界，2009，9：557.

[3] 許立春，卜平，陳平，等.莪術醇瘤苗生物治療胃腫瘤13例[J].腫瘤學雜志，2007，13（4）：303-305.

[4] 張曉麗，吳品昌，劉宇，等.乙醇注入法制備莪術醇脂質體[J].中國實驗方劑學雜志，2012，18（4）：10-12.

[5] 張艷晶，鄧意輝，楊強，等.硫酸銨梯度法制備蘋果酸舒尼替尼脂質體[J].中國新藥雜志，2012，21（5）：563-566.

[6] 趙海英，王思玲，蘇德森.促肝細胞生長素凍干脂質體的制備與物理化學性質研究[J].沈陽藥科大學學報，2001，18（6）：391-394.

[7] 歐春鳳，葉盛英，張靜，等.薄膜-均質法制備番紅素脂質體的工藝研究[J].南方農業學報，2012，43（4）：511-514.

[8] 薛紅.中藥脂質體制備的研究進展[J].中國醫藥指南，2011，9（30）：32.

[9] 劉躍華.茯苓多糖脂質體的制備[J].現代中藥研究與實踐，2012，25 （5）：46-48.

（收稿日期：2012-12-11）