注射用鹽酸吉西他濱無(wú)菌方法驗(yàn)證

[摘要] 目的 對(duì)注射用鹽酸吉西他濱的無(wú)菌檢查方法進(jìn)行探討，建立其無(wú)菌檢查方法。 方法 按中國(guó)藥典2010附錄ⅪH無(wú)菌檢查方法進(jìn)行。 結(jié)果 在驗(yàn)證條件下，該方法能消除對(duì)微生物生長(zhǎng)的抑制作用。結(jié)論 可以采用此法對(duì)本品進(jìn)行無(wú)菌檢查。

[關(guān)鍵詞] 注射用鹽酸吉西他濱；無(wú)菌方法；驗(yàn)證

[中圖分類(lèi)號(hào)] R927 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 2095-0616（2013）04-55-02

鹽酸吉西他濱（gemcitabine hydrochloride）化學(xué)名2-脫氧-2，2-鹽酸二氟脫氧胞苷（β-異構(gòu)體），是一種阿糖胞苷類(lèi)似物，由美國(guó)禮來(lái)公司研發(fā)的核苷類(lèi)抗代謝抗癌藥[1]。屬于新型抗嘧啶核苷酸代謝化療藥物，屬細(xì)胞周期特異性抗代謝類(lèi)藥物，主要作用于DNA合成期的腫瘤細(xì)胞，即S期細(xì)胞。在一定條件下，可以阻止G1期向S期的進(jìn)展；具有抗瘤譜廣、作用機(jī)制獨(dú)特、毒性反應(yīng)低、與其他化療藥物無(wú)交叉耐藥且毒性反應(yīng)無(wú)疊加等特點(diǎn)。在過(guò)去的臨床工作中，觀察到鹽酸吉西他濱是療效較好而毒副反應(yīng)較少的化療藥物之一[2-3]。無(wú)菌檢查、細(xì)菌內(nèi)毒素、微生物限度檢查是藥品安全性檢查的重要項(xiàng)目[4]，本品為凍干粉針按照中國(guó)藥典2010版附錄ⅠB[5]的要求，要進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。

1 材料與方法

1.1 儀器

HTY-2000A全封閉集菌儀和NKF集菌培養(yǎng)器（杭州高德泰林有限公司），LS-B50L立式壓力蒸汽滅菌鍋，SP120水夾套恒溫培養(yǎng)箱，PYX-DHS-50X65-BS隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱，MJX-160B霉菌培養(yǎng)箱。AKL1500凈化工作臺(tái)。

1.2 試劑

培養(yǎng)基：硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，改良馬丁培養(yǎng)基，營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，0.1%無(wú)菌蛋白胨水溶液，0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液。實(shí)驗(yàn)菌株：白色念珠菌[CMCC（F）98 001]，黑曲霉[CMCC（F）98 003]，銅綠假單胞菌[CMCC（B）10 104]，金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26 003]，枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63 501]，生孢梭菌[CMCC（B）64 941]，大腸埃希菌[CMCC（B）44 102]以上菌種均為江蘇省康華醫(yī)藥科技實(shí)業(yè)中心。

1.3 方法

1.3.1 樣品供試液的制備 取本品160支，每10支用400 mL的0.1%蛋白胨水溶液復(fù)溶，平行制備16瓶，作為供試液。

1.3.2 菌液的制備 稀釋液為0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液、含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液。

接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，接種生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)，按10倍系列稀釋至10-5～10-7。取生孢梭菌的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基培養(yǎng)物與標(biāo)準(zhǔn)比濁管對(duì)比，取與比濁管相當(dāng)?shù)木喊?0倍系列稀釋至10-7。接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中，培養(yǎng)，按10倍稀釋至10-5、10-6備用。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中，培養(yǎng)5～7 d，加入3～5 mL含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，吸出孢子懸液（用管口帶有薄的無(wú)菌棉花或紗布能過(guò)濾菌絲的無(wú)菌毛細(xì)吸管）至無(wú)菌試管內(nèi)，用含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成每1毫升含孢子數(shù)50～100 cfu的孢子懸液。取上述各菌的最后兩級(jí)稀釋菌液各1 mL，平行制備2皿，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基15～20 mL，營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平皿于30～35℃培養(yǎng)24～48 h、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基平皿于23～28℃培養(yǎng)48～72 h，取生孢梭菌的陽(yáng)性對(duì)照菌液1 mL接入100 mL硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基于30～35℃培養(yǎng)18～24 h計(jì)數(shù)。見(jiàn)表1。

1.3.3 無(wú)菌檢查[5]過(guò)程

1.3.3.1 培養(yǎng)基的靈敏度檢查 取12 mL/管的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基管，分別接種<100 cfu的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、生孢梭菌、枯草芽孢桿菌對(duì)照菌液各1 mL，另1支作為空白對(duì)照；取9 mL/管的真菌培養(yǎng)基管，分別接種

<100 cfu的白色念珠菌、黑曲霉對(duì)照菌液各1 mL，另1支作為空白對(duì)照；硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基管于培養(yǎng)3 d；白色念珠菌、黑曲霉于培養(yǎng)5 d。在培養(yǎng)的3～5 d內(nèi)，空白對(duì)照管均無(wú)菌生長(zhǎng)，加菌的各培養(yǎng)基管均生長(zhǎng)良好，判該批硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基的靈敏度檢查符合規(guī)定

1.3.3.2 培養(yǎng)基的無(wú)菌性檢查 取兩種培養(yǎng)基各5瓶，分別置于各自的培養(yǎng)溫度下空白培養(yǎng)14 d。空白培養(yǎng)管均無(wú)菌生長(zhǎng)，判該批硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基的無(wú)菌性檢查符合規(guī)定。

1.3.3.3 方法 方法1：取一套二聯(lián)培養(yǎng)器用30～50 mL 0.1%蛋白胨水溶液潤(rùn)濕濾膜。將2瓶供試液全量通過(guò)一次性使用的全封閉集菌培養(yǎng)器的二個(gè)濾器，然后用0.1%無(wú)菌蛋白胨水溶液淋洗濾膜（400 mL/膜，100 mL/次），每次均在振蕩儀上振搖，使可能附著在培養(yǎng)器壁上的抑菌成分沖掉，在兩個(gè)濾器中分別加入100 mL的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，其中一個(gè)濾器加入10～100 cfu的金黃色葡萄球菌，另一個(gè)濾器加入10～100 cfu的枯草芽孢桿菌，作為供試品陽(yáng)性對(duì)照管。另取一套培養(yǎng)器，不加供試品，其它同上操作，作為陽(yáng)性對(duì)照管。另取一套濾器，除供試品外同上操作，其中一管加入100 mL的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，另一管加入100 mL的改良馬丁培養(yǎng)基，作為陰性對(duì)照。取供試品與銅綠假單胞菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉同上法操作。其中白色念珠菌、黑曲霉用改良馬丁培養(yǎng)基。方法2：同上操作，沖洗液的用量為600 mL/膜，100 mL/次。

2 結(jié)果

觀察、記錄結(jié)果分析，見(jiàn)表2、3。

3 討論

采用方法1檢查，供試品陽(yáng)性對(duì)照管（白色念珠菌、黑曲霉）均顯見(jiàn)有微生物生長(zhǎng)，且與陽(yáng)性對(duì)照管相近，但供試品陽(yáng)性對(duì)照管（大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌）雖見(jiàn)有微生物生長(zhǎng)，與陽(yáng)性對(duì)照管比較，生長(zhǎng)比較微弱且緩慢，說(shuō)明在此條件下，供試品對(duì)微生物的生長(zhǎng)還有一定的抑制作用。

采用方法2檢查，供試品陽(yáng)性對(duì)照管（白色念珠菌、黑曲霉、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌）

均顯見(jiàn)有微生物生長(zhǎng)，與陽(yáng)性對(duì)照管比較，微生物生長(zhǎng)明顯，說(shuō)明在此條件下，供試品對(duì)微生物的生長(zhǎng)無(wú)抑制作用。因此，取驗(yàn)證方法2作為注射用鹽酸吉西他濱（0.2 g）的無(wú)菌檢查方法。

[參考文獻(xiàn)]

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[2] 李留樹(shù)，王如良.非小細(xì)胞肺癌的治療進(jìn)展[J].解放軍保健醫(yī)學(xué)雜志，2011，3（1）：199-200.

[3] 陳新謙，金有豫，湯光.新編藥物學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2004：675-676.

[4] 許玉華，杜鵑，湯楊.藥品微生物污染檢測(cè)方法驗(yàn)證的必要性[J].中國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn)，2005，6（4）：46.

[5] 國(guó)家藥典委員會(huì)編.中國(guó)藥典二部附錄[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：6，103.

（收稿日期：2013-01-04）