等基線多波長覆蓋融合結合相對校正因子測定丹參中3種成分含量

[摘要] 目的 建立以等基線多波長覆蓋融合技術結合相對校正因子計算方法同時測定丹參藥材中丹酚酸B、迷迭香酸、紫草酸含量的方法。 方法 等基線三波長覆蓋融合后以丹酚酸B為內標成分，建立迷迭香酸、紫草酸與丹酚酸B的相對校正因子，比較等基線多波長覆蓋融合結合校正因子法與外標法含量測定結果之間的差異。 結果 8批丹參藥材中3個指標性成分，采用等基線多波長覆蓋融合結合相對校正因子法計算的含量值與外標法實測值之間差異無統計學意義。 結論 等基線多波長覆蓋融合結合相對校正因子法可用于丹參中3種成分含量的同時測定，為中藥質量評價提供了新的方法。

[關鍵詞] 丹參；丹酚酸B；迷迭香酸；紫草酸；等基線多波長覆蓋融合；相對校正因子

[中圖分類號] R284.2；R927.2 [文獻標識碼] B [文章編號] 2095-0616（2013）04-100-03

丹參為唇形科鼠尾草屬植物丹參Salvia miltiorrhiza Bunge的干燥根及根莖[1]。始載于《神農本草經》名為郄蟬草或卻蟬草，被列為上品，歷代本草均有收載。丹參歸心、肝經，藥性微寒，味苦、無毒，具有祛瘀止痛、活血調經、養心除煩的功效。丹參在臨床上廣泛用于治療心血管系統疾病，具有擴張冠狀動脈、增加冠脈血流量、防止心肌缺血和心肌梗塞、改善微循環、降低心肌耗氧量等作用。而丹參的水溶性酚酸類化合物（丹參素、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸等），受到醫藥學家的極大重視[2]。本實驗采用新的研究方法組合對其酚酸類成分進行了深入的研究。

1 儀器與試藥

Agilent 1100高效液相色譜儀（美國，Agilent公司），包

括高壓二元梯度泵、自動進樣器、柱溫箱、DAD檢測器，Agilent 1100色譜工作站；HS6150型超聲波清洗器（天津恒奧科技發展有限公司）；Sartorius CP225D電子分析天平（北京賽多利斯天平有限公司）；RE-52AA旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；SHZ-DⅢ型循環水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責任公司）；Millipore超純水器（美國，Millipore公司）。

丹參藥材（分別購自山東、四川、甘肅、云南、河北、江蘇、安徽等地，經遼寧中醫藥大學翟延君教授鑒定均為正品）；迷迭香酸對照品（批號：111871-201001，純度≥98%，中國藥品生物制品檢定所），丹酚酸B對照品（批號：111562-200807，純度≥98%，中國藥品生物制品檢定所）、紫草酸對照品（批號：110326，純度≥98%，四川維克奇生物科技有限公司），乙腈（色譜純，TEDIA公司），甲醇（色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司），冰醋酸（色譜純，天津市科密歐化學試劑開發中心），實驗用水均去離子水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱Agilent TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）。流動相：A相位1.2%醋酸水，B相乙腈，線性梯度洗脫程序：0 min（5% A）-40 min（41% A）；體積流量：1.0 mL/min；進樣量10 μL；柱溫30℃；DAD檢測器在波長254、286、330 nm下同時進行檢測。見圖1。

2.2 對照品溶液的制備

分別精密稱取迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B對照品一定量置棕色量瓶中，以甲醇為溶劑，配制成單一對照品溶液，分別吸取各對照品溶液配制成含迷迭香酸0.18 mg/mL、紫草酸0.16 mg/mL、丹酚酸B 0.51 mg/mL的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取丹參藥材粉末（過30目篩）1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加水25 mL，密塞，稱重，超聲處理30 min，放冷，再稱重，用水補足失重，搖勻，濾過，取續濾液，備用。

2.4 等基線多波長覆蓋融合后方法學考察

2.4.1 線性關系考察 取迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B混合對照品溶液，分別進樣5、10、15、20、25、30 μL，在上述色譜條件下分別測定在330、254、286 nm吸收波長下的峰面積，以進樣量為橫坐標，以峰面積為縱坐標進行線性回歸。見表1。

2.4.2 精密度試驗 取產自山東丹參藥材供試品溶液，進樣10 μL，連續進樣6次，記錄各成分峰的峰面積，結果丹酚酸B、紫草酸、迷迭香酸峰面積的RSD （%）分別為1.10、0.95、0.98。表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復性試驗 取產自山東丹參藥材1 g，精密稱定，共6份，按供試品溶液制備方法操作，置于25 mL容量瓶中。按以上色譜條件分析，進樣量10 μL，測定每份樣品中丹酚酸B、紫草酸、迷迭香酸的平均含量（%）分別為4.164、0.369、0.347，RSD（%）分別為1.30、1.48、1.39。

2.4.4 穩定性試驗 取產自山東藥材供試品溶液，于0，2，4，6，8，12 h分別進樣10 μL，測定各成分峰面積，結果各色譜峰相對峰面積的RSD（%）分別為0.54、0.86、0.72，表明供試品溶液在12 h內保持穩定。

2.4.5 加樣回收率試驗 取丹參（山東）藥材粉末約6份，每份約1 g，精密稱定，分別加入迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B對照品溶液適量，制備供試品溶液，計算回收率，結果迷迭香酸，紫草酸和丹酚酸B的平均回收率（%）是98.4、102.5、100.9，RSD（%）分別為2.05、1.12、1.67。

2.4.6 樣品的含量測定 取同一丹參（山東）藥材粉末約1 g，精密稱定，制備供試品溶液，精密吸取10 μL，按以上色譜條件進樣分析。測得丹參藥材中迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B的含量見表2。

2.5 等基線三波長覆蓋融合結合相對校正因子法測定丹參中3成分含量與外標法的比較

以丹酚酸B對照品成分為內標成分，相對校正因子fkm=fk/fm=（Wk×Am）/（Wm×Ak）；Wm=（Wk×Am）/（fkm×Ak）；式中Ak為內標成分對照品的峰面積，Wk為內標成分對照品的濃度，Am為被測組分的峰面積，Wm為被測組分的濃度[3]。按以上色譜條件計算，融合后成分間丹酚酸B與迷迭香酸、紫草酸的相對校正因子分別為1.79、1.18（n=6）。

分別稱取8個不同產地丹參藥材粉末（過30目篩）1 g，精密稱定，制備供試品溶液，分別精密吸取對照品溶液與各供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀，依法測定。見表2。等基線覆蓋融合結合相對校正因子法與外標法測定丹參藥材中3種成分含量，通過SPSS 17.0軟件進行t檢驗，表明這2種方法的測定結果差異無統計學意義（P>0.05）。

3 討論

3.1 樣品提取方法的選擇

分別對提取溶劑，提取方式，提取時間進行考察，采用了水回流提取，水超聲處理，提取次數，超聲時間考察，結果表明兩者得到的色譜圖差異無統計學意義，因此采用水超聲處理30 min提取方法提取丹參水溶性成分，方便省時處理簡單。

3.2 檢測波長的選擇

經過全波長掃描，結合3D光譜圖，確定迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B分別在330、254、286 nm下色譜峰信號最強，而在其他波長下色譜峰信號較弱。采用現代分析檢測手段和計算機信息融合方法建立3種成分三波長等基線融合譜的方法，避免了同一波長下檢測樣品中的幾種成分時由于某些成分的響應值較低或受到信噪比的干擾，使定量結果不準確的缺點。將各成分以其最大吸收波長融合，在增大信噪比的同時，縮短了時間，以確保質量檢測更加穩定、可靠。可是對于信號較強但無法獲取對照品的成分含量難以測定[4-5]。

3.3 相對校正因子的應用

研究發現，在中藥各成分間存在著一定的比例關系，只要各成分的量符合該比例關系，中藥的多指標質量控制可以依此法完善。選取其保留時間與其他成分的分離度較好，價位低廉而且其穩定性較高的待測成分為內標成分，以達到在缺省對照品或省去昂貴對照品的前提下準確的對其他成分進行含量測定，快速，廉價的目的[6]。但是對于響應值較低的成分難以準確定量測定。

3.4 等基線多波長覆蓋融合結合相對校正因子法優點

中藥是個復雜的體系，因此應該以復雜性科學理論和方法加以認識和控制，故本文運用此方法建立丹參3種水溶性成分的含量測定加以說明。融合兩個方法的優點屏蔽單應用的不足，在增加信噪比，縮短檢測時間，節省對照品的同時保證每個待測成分不會受檢測波長及信噪比的影響而減小了檢測誤差，實現質量檢測的全面和整體評價。

[參考文獻]

[1] 中華人民共和國藥典編委會.中國藥典[S].一部.北京：中國醫藥科技出版社，2010：70-71.

[2] 金樟照，祝明，張文婷，等.不同產地丹參水溶性成分和脂溶性成分指紋圖譜測定及相關性研究[J].中草藥，2004，，10，35（10），1175-1176.

[3] 張坤，徐瑾，陳正收，等.高效液相色譜校正因子法測定苦碟子提取物中5種主要成分的含量[J].中南藥學，2011，9（8），578-579.

[4] 聶磊，胡震，羅國安，等.中藥指紋圖譜的融合技術[J].分析化學，2005，33（6）：898.

[5] 衛仲河，孟憲生，包永睿，等.HPLC三波長融合法對芒硝三棱相畏物質基礎研究[J].中藥材，2011，34（6）：914-916.

[6] 羅祖良，仇峰，韋日偉，等.相對校正因子在中藥多指標測定中的應用研究進展[J].中草藥，2012，43（7）：1449.

（收稿日期：2012-11-13）