食源性肥胖致不孕大鼠下丘腦弓狀核內GnRH的表達下調

[摘要] 目的 探討食源性肥胖致不孕大鼠中樞性激素表達變化以及對性腺軸的影響。 方法 將100只剛斷乳雌性SD大鼠分2組。正常組20只，給予普通飼料。高能飼料組80只，飼高能飼料，根據Lee's指數及陰道涂片檢查篩選出肥胖不孕大鼠22只，作為實驗組。檢測E2、T、leptin、FSH、LH的水平；觀察卵巢的形態學變化以及促性腺激素釋放激素在下丘腦弓狀核的表達情況。 結果 實驗組較正常組大鼠血清E2、T、leptin水平明顯升高，FSH、LH水平明顯降低；下丘腦弓狀核GnRH表達明顯減弱；實驗組大鼠卵巢體積明顯減小，卵巢中未見接近成熟的卵泡及黃體。 結論 肥胖導致大鼠的神經內分泌代謝紊亂，致使下丘腦-垂體-卵巢軸功能失調性無排卵而引起不孕。

[關鍵詞]促性腺激素釋放激素；肥胖；不孕；大鼠；雌性

[中圖分類號] R-332 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2013）04-24-03

不孕癥是常見的婦產科疾病之一，大約影響到至少10%～15%的育齡夫婦，是全球性的健康問題，影響著婚姻、家庭及社會等各方面。多種原因可以導致女性不孕癥，其中首要的病因診斷為卵巢排卵障礙，約占25%～30%[1]。排卵障礙是很多內分泌疾病的共同表現。近年來流行病學研究證實肥胖也可能導致生殖內分泌功能失調。那么肥胖前后調節生殖的神經內分泌是如何發生改變的？卵巢的形態學結構是否會發生變化？目前研究甚少。本研究通過建立食源性肥胖大鼠模型，明確下丘腦弓狀核生殖因子的表達、內分泌的變化及卵巢的形態學變化，從而探究肥胖與不孕之間的關系。

1 材料與方法

1.1 模型制作

取100只剛斷乳雌性SD大鼠，隨機分成2組。正常組20只，給予普通飼料（普通飼料：大麥粉20%，玉米粉16%，麩皮16%，脫水菜10%，豆粉20%，酵母1%，骨粉5%，魚粉10%，食鹽2%）。高能飼料組80只，給予自制高能飼料（高能飼料：上述普通飼料每100克中加入魚肝油10滴、奶粉10 g，豬油15 g，雞蛋15 g和新鮮黃豆芽25 g）。喂養至14周，根據Lee's 指數篩選食源性肥胖大鼠模型。并連續11 d進行每日陰道涂片檢查，陰道上皮持續角化無出現動情周期認為肥胖不孕模型[2]。最終篩選出22只肥胖且不孕大鼠作為實驗組。

表2 兩組血清激素變化（）

組別nE2（pg/mL）T（nmol/L）leptin（ng/mL）FSH（ng/mL）LH（ng/mL）

正常組1173.34±5.250.16±0.051.78±0.321.76±0.239.75±0.35

實驗組11 87.44±3.14* 0.29±0.11* 3.89±0.12** 1.09±0.32* 7.15±0.24*

注：與正常組比較，*P<0.05；**P<0.01

1.2 動物取材

兩組大鼠分別稱重、腹腔注射麻醉，取血離心后待測血清激素水平，取腹膜后脂肪稱重。行4%多聚甲醛心內灌流固定，斷頭取腦及卵巢甲醛后固定、脫水、透明和包埋。

1.3 免疫組織化學染色

參照Koning等[3]大鼠腦定位圖譜，從A5150～A3180 [弓狀核（ARC）-正中隆起（ME）所在的平面]，恒冷箱切片（20μm），行ABC法免疫組化染色，所用抗體濃度GnRH（1∶100）對照組用PBS代替Ⅰ抗，結果陰性。光學顯微鏡下計數陽性細胞數并用MIAS-2000圖像分析系統測定陽性纖維灰度值。

1.4 RIA法測定血清雌二醇血清（E2）、睪酮（T）、瘦素（leptin）、卵泡刺激素（FSH）及黃體生成素（LH）水平

方法略。

1.5 統計學處理

采用SPSS17.0軟件進行統計學處理，數據以（）表示，方差齊時應用方差分析，方差不齊進行秩和檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 體質量、腹膜后脂肪質量、Lee's指數和脂肪系數的改變

實驗組大鼠體重增加明顯，腹膜后脂肪堆積超過正常組，并且Lee’s指數及脂肪系數均明顯增加，差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。

2.2 卵巢的形態學改變

正常組卵巢內各級卵泡發育良好，部分卵母細胞及周圍透明帶、放射冠清晰可見，次級卵泡和成熟卵泡的卵丘、卵泡膜發育正常，并且可見成熟卵泡明顯突起卵巢表面。見圖1。實驗組大鼠卵巢體積減小，卵巢中可以見到大量原始卵泡，但初級、次級卵泡極少，未見成熟卵泡及黃體。見圖2。

2.3 血清激素變化

相比較對照組，實驗組血清E2、T、leptin水平明顯升高，FSH、LH水平降低。見表2。

2.4 下丘腦弓狀核GnRH表達變化

實驗組大鼠下丘腦弓狀核GnRH免疫陽性胞體數及纖維灰度值均明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05）。見表3，圖3～4。

3 討論

肥胖病是人類目前面臨最容易被忽視，但發病率卻在急劇上升的一種疾病。隨著人們對肥胖相關基因產物——瘦素認識的逐步深入，瘦素被認為是肥胖病激素源性研究中的一個重大進展。瘦素與肥胖，瘦素與生殖之間的關系已成為目前人們關注的焦點之一。研究認為，leptin是通過反饋作用于中樞神經系統（主要是下丘腦）和外周組織（比如胰腺、內臟脂肪等）兩條途徑實現其生物學作用的。瘦素抑制食欲的作用就是通過抑制下丘腦-神經肽Y（NPY）通路中NPY的mRNA表達而實現的[4]。leptin與下丘腦內的瘦素受體ob-r結合，將代謝信息傳遞給代謝相關組織，發揮減重的作用。我們前期實驗結果表明，肥胖大鼠血清中leptin水平明顯升高，弓狀核NPY表達增強，而ob-R表達降低[5]。因此，在肥胖病機體體內，大部分并不是由于缺乏leptin而引起肥胖， 提示肥胖患者體內可能存在瘦素抵抗[6]。

隨著研究的深入，目前發現瘦素可以刺激下丘腦飽食中樞調控攝食行為和脂肪代謝，還可以通過影響中樞神經系統間接或直接作用于生殖器官[7]，調控人類生殖內分泌的代謝作用。瘦素通過自分泌和旁分泌方式[8]調節營養與代謝信號間的生殖能力，在各種不孕不育的病理生理中扮演重要的角色。Hindlet等[9]研究證實，leptin可以恢復雌性ob/ob鼠的生殖力。雌性ob/ob鼠早期的性發育正常，但其發育一直停留在青春前期。用人工瘦素治療，可以減輕體重，也可恢復其生育力。而單用飲食控制未見此作用，由此可見leptin在調節正常生殖功能過程中起著一定的作用。但是，原位雜交結果顯示，在下丘腦弓狀核GnRH神經元上確實不表達ob-RmRNA[10]，因此leptin不能直接作用于GnRH神經元。有實驗證實，NPY神經元上確實存在ob-R分布[11]，提示leptin可能通過NPY神經元間接作用與GnRH神經元從而調節生殖力。結合前期研究結果，肥胖大鼠血清中leptin水平明顯升高，弓狀核NPY表達增強，ob-R表達減弱，以及本實驗結果，食源性肥胖大鼠弓狀核GnRH免疫陽性表達減弱，血清中FSH和LH降低可知食源性肥胖大鼠弓狀核NPY表達明顯增強，提示大鼠肥胖可能與NPY神經元活性的超表達有關。脂肪生成增加，致leptin分泌增加。而肥胖大鼠在高濃度E2作用下，增高的NPY抑制GnRH的分泌和釋放，作用于下丘腦-垂體-卵巢軸，使垂體分泌的FSH及LH進一步下降，從而影響卵泡的發育，導致功能失調性無排卵而影響受孕。故Leptin與NPY形成一對共軛子，共同“監視”著機體的代謝和生殖，從而影響能量代謝和生殖功能，造成肥胖-無排卵的惡性循環。

然而，NPY是否直接作用于GnRH神經元，是否還有其它介質調控其分泌，還有待于進一步實驗研究。

[參考文獻]

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（收稿日期：2012-12-28）