Nrf—2—ARE信號通路在胃癌治療研究中的作用及機制

[摘要] Nrf-2-ARE信號轉導通路是機體最重要的抗氧化應激系統之一，在腫瘤的發生發展中扮演著雙重作用，一方面可以預防腫瘤的發生；另一方面近期的研究發現，Nrf-2在腫瘤發生發展的過程中也起了重要作用。Nrf-2及其下游基因在許多癌前病變及腫瘤組織中表達異常升高，促進了異常增殖的細胞向腫瘤方向分化，腫瘤細胞的生長分裂能力增強，同時Nrf-2的升高能使腫瘤細胞對化療藥物敏感性下降，是腫瘤細胞耐藥機制中的重要一環。然而，胃癌是威脅人類健康的惡性腫瘤之一，它的發生發展是一個涉及到分子和細胞改建的多步驟過程。由于受檢測方法及技術的限制，目前早期胃癌檢出率低，多數胃癌患者在確診時已達中晚期，因此化學治療在胃癌患者的綜合性治療中具有重要作用，但是化學治療在腫瘤中的應用卻存在著亟須攻克的問題-多藥耐藥。已有研究表明，Nrf-2在不同期胃癌、癌前病變中存在不同水平的高表達，對胃癌的發生發展有一定的促進作用，Nrf-2在細胞核中的堆積是一些腫瘤產生耐藥性的原因。本資料就Nrf-2在胃癌發展過程中的作用及機制作相關闡述。

[關鍵詞] Nrf-2；胃癌；耐藥機制

[中圖分類號] R735.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2013）04-32-04

1 Nrf-2-ARE信號通路的結構功能及作用機制

Nrf-2-ARE信號轉導通路的核心分子包括核抗氧化反應元件（antioxidant response element，ARE）、轉錄因子紅細胞系-2p45（NF-E2）相關因子-2（nuclear fac-tor erythroid-2p45-related factor 2，Nrf-2）和Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白-1（Kelch-like ECH-associatedprotein 1，Keap1）。核因子E-2-相關因子2 （NuclearFactor-E2-related factor 2，Nrf-2）屬于轉錄因子CNC（cap n collar）亞家族一員，分子量為66 kDa，含有一個高度保守的呈堿性拉鏈狀的亮氨酸結構，能夠與作為珠蛋白基因簇啟動子的NF-E2/APl結構相結合，使轉錄激活。其中Nrf-2含有的6個結構域均高度保守：Neh l具有能與DNA結合及參與其他轉錄因子的聚合所不可缺少的亮氨酸拉鏈結構。另外，Nehl還含有核定位信號域。Neh 2含有ETGE和DLG兩個模塊，可結合Kelch域，Keapl正因為含有該結構域而作為Nrf-2的負調節因子，還含有七個賴氨酸殘基，這些氨基酸是Nrf-2泛素化降解必需的，與Nrf-2途徑的關閉與激活密切相關。Neh3可參與Nrf-2轉錄激活，該過程由CHD6輔助因子所介導。Neh4和Neh5是兩個獨立的協調作用的反式結構域，兩者均富含酸性氨基酸殘基。Neh6作用目前研究結果看尚不清楚[1-4]。當細胞微環境內氧化還原處于平衡狀態時，Nrf-2與其負性蛋白伴侶分子Keap1相結合存在于細胞質而處于被抑制狀態，Keapl可促進Nrf-2被泛素蛋白酶體降解。Keapl是Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白-1，含有BTB（broadcomplex，tramtrack，brica-brac）域和Kelch域兩個主要的結構域，主要通過Kelch域與Nrf-2的ETGE域結合發揮以上作用，從而使Nrf-2的表達量維持在較低水平。當氧化還原失去原有的平衡，內外源有害親電子性代謝物或活性氧增高產生增多的情況下，細胞質中的Keap1構像和氨基酸會發生改變，這些改變使得Nrf-2與其解離進入核內，啟動下游基因的轉錄，這些基因受ARE序列調控，進一步激活谷胱甘肽過氧化物酶、硫氧化蛋白等蛋白、谷胱甘肽-S-轉移酶和NAD（P）H-醌還原酶等在內的II相解毒酶、多藥耐藥相關蛋白等的表達，從而扭轉氧化還原失衡的狀態，加速致癌物和抗癌藥物的排除，增強受損蛋白的識別、修復及清除，加速核苷酸的切除修復。還可調節其他轉錄因子、生長因子的表達，有效抑制細胞因子介導的炎癥反應[5-7]。

2 胃癌發生發展中Nrf-2的作用

近年來，Nrf-2-ARE通路與腫瘤發生以及發展的存在著重要關系，這在很多研究中均得到了證實。研究發現，在高危致癌外環境中Nrf-2的激活可以保護正常細胞，然而在過氧化環境及藥物作用下也能夠促進腫瘤細胞的持續生長。在消化道腫瘤中，Nrf-2在肝癌發生發展過程中有促進作用，已被Ikeda H等的研究所證實。此項研究表明肝癌細胞中Nrf-2存在高表達，并和腫瘤標志物GSTPl均較正常細胞表達高很多，還證實了Nrf-2可與GSTPI啟動子區域的ARE序列結合來調控其表達。而GSTP1被視為一種瘤樣變的標志物，正常組織不表達，在腫瘤組織中高表達[8]。毛景濤等[9]研究了Nrf-2在食管鱗癌組織中的表達及其與臨床病理學特征的關系，結果顯示Nrf-2在食管鱗癌中高表達，表達的高低與淋巴結轉移與否及轉移度有關。在原發性膽囊癌中，楊海明等通過對不同病理類型，不同分級的研究表明Nrf-2的高表達參與了原發性膽囊的發生發展，Nrf-2與原發性膽囊癌的分化、轉移有關[10]。王洪波通過對Nrf2在正常胃黏膜組織、胃增生性息肉、胃上皮內瘤變、胃腺癌的表達研究，表明Nrf-2在病變組織中均有高表達，且隨著惡性程度的增加而升高，差異有統計學意義[11]。腫瘤細胞中往往存在著氧化還原環境的改變，胃癌細胞也不例外。幽門螺旋桿菌（H.Pylori）作為胃癌發生、發展中的一大重要因素，在H.Pylori感染后，可促使多形核細胞、單核細胞、巨噬細胞和嗜中性粒細胞發揮炎性趨化作用而激活，產生氧自由基，從而誘導氧化應激[12-13]。COX-2作為胃癌發生、發展、分化、侵襲浸潤的另一大因素，通過產生花生四烯酸，激活細胞膜上的鈣通道致鈣內流，增加的鈣離子激活NAD-PH氧化酶，以及和高糖共同作用能夠激活蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）進而激活PKC依賴的NADP氧化酶等途徑，產生大量活性氧自由基以及通過電羰基衍生物（electrophilic oxo-derivatives，EFOX）分子的硫醇與半胱氨酸、組氨酸等蛋白質殘基加合，激活依賴于ARE基因表達的Nrf-2[14-16]。在引起胃癌發生的很多其他因素諸如外源性物質、藥物、重金屬和電離輻射都可以導致氧化應激反應，導致活性氧產生。在氧化應激中產生的活性氧可以直接對Keap1的半胱氨酸殘基進行修飾引起Keap1的構象變化進而導致Nrf-2與Keap1解離，Nrf-2轉入細胞核中與ARE結合，啟動下游多種保護性基因的表達，如抗氧化蛋白類基因、Ⅱ相解毒酶基因、分子伴侶類基因和抗炎因子類基因等，其中抗氧化酶類催化氧自由基轉化為無毒物質和增加其水溶性使自由基排除細胞，從而維持機體的氧化還原平衡[17]。徐華等[18]在萊菔硫烷誘導人胃癌SGC-7901細胞凋亡與胞內活性氧的關系的研究結果顯示萊菔硫烷對SGC-7901細胞的增生抑制及誘導凋亡作用，可能是通過誘發細胞內活性氧水平增高，引發經線粒體途徑的內源性凋亡而實現的。馬建國[19]研究顯示干擾Nrf-2能增強Hirsutanols A（從南海珊瑚Sarcophyton tortuosum的內生菌中分離的一個倍半萜類化合物，能誘導過氧化氫的產生從而殺死腫瘤細胞）能誘導SW480、HepG2產生大量ROS，并殺死腫瘤細胞。蔣崇輝[20]對活性氧生成在8-硝基白楊素誘導人胃癌SGC-7901細胞凋亡中的作用的研究表明：8-硝基白楊素通過誘導活性氧的生成產生誘導癌細胞凋亡的作用。諸如此類的研究表明腫瘤細胞中大量的氧自由基可以促進腫瘤細胞調亡，殺死腫瘤細胞。基于以上研究，腫瘤細胞中活性氧的增加可以誘導細胞凋亡，而活化的Nrf-2進入細胞核與藥物代謝、清除ROS相關基因的啟動子結合，增強其表達，降低細胞內ROS水平從而發揮了其對腫瘤細胞的保護作用，進而促進腫瘤的發生發展。

3 Nrf2-ARE信號轉導通路對胃癌耐藥性的作用

近幾年對各類腫瘤的耐藥性的研究中，關于Nrf2-ARE信號轉導通路在其中的作用引起各個研究小組的重視。張凱茹等[21]Nrf-2及其靶基因在人肺腺癌A549順鉑耐藥細胞株中的表達和意義結果表明，肺腺癌A549細胞株對順鉑的耐藥現象與Keap-1，Nrf-2以及其作用的下游基因的高表達有關。武正山等[22]在對血紅素氧合酶-1（HO-1）對人胃癌SGC7901細胞5-氟尿嘧啶（5-FU）化療敏感性的影響的研究結果顯示，HO-1的高表達伴隨著5-FU對胃癌細胞抑制率和凋亡率的下降。血紅素氧合酶-1以及和它同屬于Nrf-2轉導通路下游的II相解毒酶、抗氧化酶及藥物流出泵的基因在腫瘤耐藥性方面的作用已經得到證實。胃癌細胞中存在著Nrf-2的高表達，腫瘤細胞在體內各種氧化應激條件下，尤其在抗癌藥物作用時會啟動細胞保護機制，這在Kimet SG等[23]的研究中得到了證實，他的研究顯示，當Nrf-2被磷酸化與其胞質蛋白伴侶分子Keap-1解離，進入細胞核通過與Maf家族蛋白形成的雜二聚體再與抗氧化劑反應元件（ARE）結合從而促進Ⅱ相解毒酶中GSTP1基因的激活轉錄，上調GST-π蛋白的表達。荊薇等對胃癌細胞順鉑耐藥性的研究表明，無GST-π蛋白表達的人胃癌MGC-803細胞對順鉑敏感性強于GST-π呈強表達的BGC-823細胞，即下調GST-π蛋白在人胃癌細胞中的表達，可以增加人胃癌細胞對順鉑的敏感性[24]。此外，在乳腺癌口腔癌及膀胱癌細胞中亦存在著Nrf-2的高表達，并且與腫瘤的發生發展密切相關。在某些腫瘤細胞Nrf-2的高表達與Keap-1的點突變有關，因其對Nrf-2的負性調節作用消失，最終使Nrf-2調控的下游基因轉錄，上調相關產物的表達[25-28]。腫瘤細胞對細胞毒類藥物的解毒作用，產生耐藥性都可能是由GSH和相關解毒酶的高表達有關系。基于Nrf-2在腫瘤耐藥性中作用的相關研究，以及其在胃癌中存在高表達，故推測其在胃癌耐性方面起著重要的作用，但是現在其在胃癌中的研究頗少。

從胃癌耐藥的主要機制來看，生化耐藥起著重要的作用，即腫瘤細胞具有的生化特性和遺傳性在外界物質的作用中發生著復雜的變化，致使腫瘤細胞通過不同的機制和方式抵抗抗癌藥物對自身的殺傷，這就使得耐藥性的產生，主要包括：（1）使抗癌藥物外排出細胞及使抗癌藥物在細胞內重新分布，該機制涉及多藥耐藥基因，多藥耐藥相關蛋白和P-糖蛋白等。（2）啟動存在于細胞內的解毒系統，該作用途徑涉及P450家族、GSH|GST等。（3）通過改變存在于細胞內的藥物靶酶的水平或者藥物與內酶在細胞中的親和力改變從而促使靶耐藥的產生，主要涉及TopoⅡ、二氫葉酸還原酶等。而細胞內的解毒系統通過產生相關酶以及對抗癌藥物進行生物轉化從而解除其對腫瘤細胞的毒性作用，誘導抗癌藥物在腫瘤細胞內失活以產生耐藥[24，29-31]。而這些解毒酶在Nrf-2-ARE信號通路異常激活時大量合成，故可以推測胃癌細胞中Nrf-2的表達增加與胃癌耐藥性有必要的聯系。

4 討論

Nrf-2是近年來抗氧化抗腫瘤蛋白研究熱點之一，當腫瘤細胞中的Keapl或Nrf-2的基因發生突變，細胞內過表達的Nrf-2可以上調氧化還原平衡蛋白、Ⅱ相解毒酶、轉運蛋白的表達，它們通過轉化外排有害的活性代謝物及外源性藥物從而保護腫瘤組織，促進腫瘤細胞的生長，抑制凋亡。

在胃癌組織中Nrf-2存在著過表達，影響胃癌發生發展的因素從各個層面激活和影響著Nrf-2-ARE信號通路，例如COX-2，與胃癌的發生和淋巴結的轉移以及臨床分期等密切相關，但是其誘發腫瘤的機制尚不明確。各種研究顯示出的COX-2與Nrf-2-ARE信號通路在機體抗炎抗氧化存在著相互作用，在胃癌中兩者的關系不明確；在抗腫瘤藥物對胃癌的作用的研究結果顯示，抗腫瘤藥物通過上調氧自由基的產生促進胃癌細胞的調亡，而Nrf-2-ARE信號通路的激活卻將氧自由基清除。這些研究基礎為我們進一步研究Nrf-2在胃癌發生發展及胃癌耐藥性的作用提供了可能，為研發Nrf-2特異性抑制劑與化療相結合提高胃癌對藥物的敏感性提供了可能。Nrf-2有望成為胃癌生物治療中更有效的藥物靶點。

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（收稿日期：2012-11-15）