慢性乙肝患者外周血Treg/Th17及相關細胞因子的變化

[摘要] 目的 檢測慢性乙肝患者外周血Treg/Th17及相關細胞因子水平，探討其與慢性乙肝發病的關系。 方法 選擇30例慢性乙肝患者為觀察組，另選擇30例健康志愿者為對照組。采用流式細胞術檢測兩組外周血中Treg細胞和Th17細胞頻數，并檢測其相關的細胞因子IL-17、IL-23、IL-10及TGF-β1水平。 結果 研究組外周血Treg細胞頻數和Th17細胞頻數顯著高于對照組，而Treg/Th17顯著低于對照組，差異均有統計學意義（P < 0.05或<0.01）。研究組IL-10、TGF-β1及IL-23水平顯著高于對照組，差異有統計學意義（P < 0.01或<0.05）。而重度患者TGF-β1水平和Treg/Th17顯著高于輕中度患者，差異有統計學意義（P < 0.01）。 結論 慢性乙肝患者外周血Treg細胞和Th17細胞均明顯升高，而兩者的失衡在疾病的發生發展過程中發揮了重要的作用。

[關鍵詞] 慢性乙肝；Treg細胞；Th17細胞；細胞因子

[中圖分類號] R512.6+2 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2013）04-0108-03

慢性乙肝已成為全球醫療界的難題，我國是慢性乙肝的高發區。據統計，攜帶HBV病毒者大約有1/4的感染者發展為慢性肝炎；約有4.4%和15%的慢性肝炎患者最終發展為肝細胞癌和肝硬化。目前認為，HBV 感染后疾病的不同表現、轉歸及臨床過程與機體的免疫狀態有關，T細胞在清除和抑制病毒感染中發揮重要的作用[1]。而慢性乙肝患者的T細胞功能的缺陷與Treg細胞（調節性T細胞）升高有關。輔助性T細胞（T helper lymphocytes，Th）在免疫應答過程中發揮重要作用。Th17是近年來發現的不同于Th1和Th2細胞的亞群，與自身免疫反應具有密切的相關性[2]。正常情況下，Treg/Th17保持平衡有利于維持機體免疫狀態的穩定。當兩者比例失衡后，可導致一系列的免疫炎癥反應。本文主要是探討慢性乙肝患者外周血Treg/Th17細胞水平狀態以及與疾病的發病是否存在相關性?，F報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2012年1～6月在我院進行治療的慢性乙肝患者30例作為研究組，其中男18例，女12例，年齡23～57歲，平均（31.7±11.4）歲。其中輕度5例，中度16例，重度9例。小三陽16例，大三陽14例。入選標準：①診斷明確；②入組前3個月沒有使用影響免疫的藥物；③入組3個月沒有進行保肝和抗病毒治療。排除標準：① 其他類型的病毒性肝炎或酒精性肝炎、藥物性肝炎；②自身免疫性疾?。虎墼l性肝癌 ；④代謝性肝病。對照組為在我院進行健康體檢的志愿者，共30名。其中男15名，女15名，年齡20～55歲，平均（32.5±12.1）歲。兩組的性別、平均年齡比較差異無統計學意義（P > 0.05），具有可比性。

1.2 檢測方法

1.2.1采血方法 清晨抽取肘靜脈血8 mL，分置于2支采血管中。1支3 mL肝素抗凝，離心后分離外周血單個核細胞，進行Treg細胞和Th17細胞頻數檢測。另1支采血管靜置后分離血漿進行細胞因子及血生化檢測。

1.2.2 Th17細胞頻數檢測 采用美國BD公司FACS Calibur雙激光四色分選流式細胞儀進行檢測。采用RPMI-1640 細胞培養基（上海江萊生物科技有限公司）將收集到的外周血單個核細胞調配到細胞密度為2×106/mL，取2mL加入到6孔板內，再分別加入佛波酯（北京中西遠大科技有限公司）、離子霉素（上海葉舟生物科技有限公司）、莫能菌素（山東勝利生物工程有限公司），37℃培養5h。收集細胞于測定管和對照管中，每個管中100 μL。每個管中分別加入20 μL的CD8-PE和10 μL的CD3-PC5單克隆抗體，室溫下避光孵育15 min。然后室溫下固定液100μL進行固定反應15 min，加入PBS（上海撫生實業有限公司）緩沖液3mL，混勻后，離心，棄上清。破膜劑100μL進行細胞打孔，IL-17-FITC 20 μL加入測定管中，對照管中加入20 μL同型對照。室溫下孵育20 min后，加入PBS緩沖液3 mL，混勻后靜置10 min，棄上清，加入PBS 0.5mL重新懸浮，進行檢測。

1.2.3 Treg細胞頻數檢測 靜脈血100 μL，加入20 μL CD4-FITC和20 μL CD127-PE單克隆抗體，10 μL CD25-PC5單克隆抗體，避光下孵育20 min，加入紅細胞裂解液2 mL，避光下孵育20 min，加PBS緩沖液3mL洗滌，后加入PBS緩沖液0.5 mL重新懸浮，進行檢測。

1.2.4 細胞因子的檢測 采用ELISA法進行檢測，主要檢測血漿中IL-17、IL-10、IL-23及TGF-β1，所有操作均嚴格按照說明書進行。所使用的試劑由上海韻涵生物科技有限公司提供。

1.2.5 血生化檢測 采用BECKMAN COULTER Au5400全自動生化儀進行檢測，主要檢測總膽紅素（TBIL）、直接膽紅素（DBIL）、谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）。所有操作按說明書進行。

1.3 統計學方法

采用SPSS12.0統計學軟件進行數據處理，計數資料采用卡方檢驗，計量資料用均數±標準差表示，多組間的比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗。P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 入組時兩組血生化結果

由表1可見，在入組時，重度肝炎患者的TBIL和DBIL水平及ALT、AST水平顯著高于對照組和輕中度組，而輕中度組的ALT和AST水平顯著高于對照組，差異均有統計學意義（P < 0.01）。

2.2 兩組外周血Treg細胞頻數和Th17細胞頻數比較

由表2可見，研究組外周血Treg細胞頻數和Th17細胞頻數顯著高于對照組，而Treg/Th17顯著低于對照組，差異均有統計學意義（P < 0.05或<0.01）。

2.3 兩組細胞因子水平比較

由表3可見，研究組IL-10、TGF-β1及IL-23水平顯著高于對照組，差異有顯著統計學意義（P < 0.01或<0.05）。而重度患者TGF-β1水平顯著高于輕中度患者，差異有統計學意義（P < 0.01）。

2.4 Treg、Th17細胞頻數和Treg/Th17與慢性乙肝患者臨床指標的相關性

Treg、Th17細胞頻數在不同性別、不同年齡、HBeAg是否陽性及不同分期組中差異沒有統計學意義，而Treg/Th17重度組顯著高于輕中度組（P < 0.01）。見表4。

3 討論

慢性乙肝是一個世界性的疾病，全世界大約有2.8億的病毒攜帶者，我國約占1.3億，因此，我國是慢性乙肝病毒的高發區，大約有3000萬病毒攜帶者發展為乙型肝炎。當乙肝病毒感染機體后，進入肝細胞，形成共價閉合環DNA，成為病毒轉錄的模板，在早期即可與肝細胞DNA整合[3]。機體自身的免疫狀態與慢性乙肝的臨床癥狀、體征、轉歸等有密切關系。有研究顯示，慢性乙肝患者外周血細胞毒性T細胞活性受損，產生抗病毒細胞因子水平下降。其具體機制尚未完全明了，可能是表面抗原和e抗原的大量表達使T細胞發生免疫耐受，慢性乙肝患者對細胞毒性T細胞的負性調控分子高表達促使其功能下降或抗病毒能力下降。Treg細胞升高，抑制了細胞毒性T細胞的增殖。

調節性T細胞對機體的免疫反應具有抑制作用，在調節機體的免疫平衡方面發揮重要的作用。天然的Treg細胞主要通過細胞膜表面的分子與細胞直接接觸的方式發揮作用，而誘導產生的Treg細胞主要通過細胞因子IL-10和TGF-β發揮作用。Treg細胞在調節細胞免疫方面具有重要的作用，Treg增多或者減少均會影響到機體的免疫平衡，導致一系列的免疫疾病。研究顯示[4]，出生后切除胸腺的小鼠因為缺乏Treg細胞，可出現多種自身免疫性疾病。有研究顯示[5]，Treg細胞減少可以增加動脈粥樣硬化的發生率，加重局部損傷炎癥的反應。本文的研究結果顯示，慢性乙肝患者外周血Treg細胞的細胞頻率顯著高于對照組，說明其參與了慢性乙肝的發病過程，在肝炎的發展過程中。IL-10、TGF-β1是Treg細胞分泌的細胞因子。本研究顯示其在慢性肝炎患者外周血中的表達顯著升高。

Th17細胞也來源于原始的Th細胞，其與Treg細胞的作用相反，正常情況下兩者保持平衡，維持機體的免疫穩定。Th17細胞與多種自身免疫性疾病有關。杜永光[6]研究結果顯示，在類風濕關節炎患者外周血中Th17相關的細胞因子IL-17、IL-6和IL-23水平顯著升高。李娜[5]等研究顯示，慢性心力衰竭患者外周血中Th17細胞水平顯著升高，考慮其參與了心力衰竭的發生發展過程。本研究結果顯示，慢性乙肝患者外周血中Th17細胞頻率顯著高于正常對照組，說明Th17細胞參與了慢性乙肝的疾病過程。Th17主要分泌IL-17細胞因子，是一種前致炎細胞因子，參與炎癥的發生[7，8]。在本文中，研究組和對照組的IL-17細胞因子水平差異并不明顯，提示在慢性乙肝的發生發展過程中，IL-17可能不是主要的細胞因子。IL-23是Th17細胞分泌的另外一種細胞因子，是一種造血細胞因子，可刺激Th17細胞的擴增和維持，可以誘導初始T細胞分化成為Th17細胞[9，10]。本文研究顯示，慢性肝炎患者IL-23水平顯著升高。

Treg細胞和Th17細胞均由初始T細胞分化而來。IL-2可以抑制Th17的過度表達，同時能夠促進Treg細胞的分化，而TGF-β能夠誘導兩種細胞的分化，IL-6可以誘導初始細胞分化為Th17?？傊?，兩種細胞在分化過程中呈現相互抑制的作用，而兩者作用也呈現相互抑制。正常情況下，Treg/Th17保持平衡，以維持機體的免疫穩定。本文的研究結果顯示，研究組Treg/Th17顯著低于對照組，說明慢性乙肝患者雖然Treg和Th17明顯升高，但是Th17升高的幅度更為明顯。提示Treg細胞功能及增殖能力相對不足，而Th17細胞增殖旺盛的情況下，導致慢性肝炎的炎癥反應。但是比較重度肝炎和輕中度肝炎Treg/Th17結果發現，重度患者顯著高于輕中度患者，可能的原因是重度肝炎患者TGF-β1顯著升高，而高水平的TGF-β1可以誘導Treg細胞的生成，而低劑量的TGF-β1有利于Th17細胞的生成。增高的Treg有可能抑制Th17細胞的分化，從而發揮抑制免疫反應的作用。

綜上所述，慢性乙肝患者外周血Treg細胞和Th17細胞均明顯升高，而兩者的失衡在疾病的發生發展過程中發揮了重要的作用。本研究還存在一些局限性，比如樣本較少、研究時間較短等，對于結果的進一步驗證還需要進行大樣本研究。

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（收稿日期：2012-11-26）