金針菇多糖對運動疲勞大鼠免疫水平影響的研究

田雪文，黃 超，劉 倩，何 明

(1.山東省體育科學研究中心，山東 濟南 250102;2.山東體育學院，山東 濟南 250063)

運動性疲勞是由運動引發的不可避免的生理現象，疲勞物質在體內積累，乳酸和蛋白質分解物存留在體內，導致體內肌酸激酶、尿素氮等有所增加，SOD 活性增強，而睪酮、血紅蛋白含量有所下降［1－2］。運動性疲勞時會出現免疫功能紊亂，運動平衡失調，感染感冒、胃腸道等疾病的幾率大大增加，影響運動員比賽成績。過度運動后機體運動免疫力下降是影響運動訓練效果和運動員身體健康的一個重要因素。

金針菇(Flarnmulina velutipes)又名毛柄金錢菌、樸菇、冬菇。金針菇子實體由細長而質嫩的菌柄和形似銅錢的菌蓋組成，呈乳白色或金黃色，其蓋滑、柄脆，是目前人工栽培較為廣泛的食用菌之一。金針菇中含有豐富的多糖物質，是金針菇的主要活性成分。給大白鼠灌胃金針菇多糖溶液后，會增強T 細胞功能，促進抗體產生，增強抗氧化作用，增強抗癌能力，通過恢復和提高免疫力方法來達到抑制腫瘤的目的［3－4］。本研究通過補充金針菇多糖，揭示金針菇多糖影響運動疲勞大鼠各項血清指標的變化以及疲勞消除的效果，從而為進一步消除運動員疲勞提供理論依據，對現代競技體育的發展有積極的現實意義。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

選用7 周齡雌性健康純種Sprague－Dawley(SD)大鼠30 只，體重160 ～190 克，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供(質量合格證號:SCXK 京2012－0001)。分籠飼養，每籠3 ～4 只大鼠，顆粒飼料喂養，自由飲食、飲水，室溫22±2℃，相對濕度40%～60%，12 小時光照，每日換墊料一次。

1.2 金針菇多糖的提取

應用傳統水提法提取金針菇多糖:溫度90 ℃、浸提時間4 h、料液比1:30、提取2 次、PH7 為提取金針菇多糖的最佳工藝條件。向糖液中加入氯仿－正丁醇溶液(5:1)去除蛋白以純化多糖，金針菇多糖提取率達1.63%。

1.3 實驗動物分組

SD 大鼠按照本實驗要求隨機分為空白對照組、運動對照組、金針菇組3 組，每組10 只。

空白對照組:置于籠中自然生長，不參加跑臺訓練。

運動對照組:依照本實驗設計的運動疲勞模型，進行跑臺訓練，并在跑臺訓練后即刻灌胃與金針菇組相同劑量的0.9%生理鹽水。

金針菇組:依照本實驗設計的運動疲勞模型，進行跑臺運動，并在每次跑臺訓練后即刻灌胃2 ml 金針菇多糖水溶制劑(按照150 mg/kg 體重計算)。

1.4 運動方案

根據圖4液壓泵消耗功率可得:無動態規劃優化,液壓泵消耗的功率主要集中在[2.5×104,4.0× 104] W之間,最大消耗功率為6.1×104 W;有動態規劃優化后,液壓泵消耗的功率主要集中在[1.0×104,2.0×104] W之間,最大消耗功率為4.9×104 W.采用動態規劃優化后的液壓冗余機械臂,其消耗的功率較小,運動相對平穩.

1)環境適應:大鼠購入以后在動物房適應性喂養2 天，以便適應動物房環境;

2)跑臺適應:第3 ～6 天讓大鼠做適應跑臺運動，跑臺速度為15 m/min，時間為10 min。大鼠跑臺訓練持續9 周，每周訓練6 天，周日休息。

本研究在大鼠完成適應性訓練后，采用上海體育學院陳佩杰、王茹［5］等人的跑臺運動模型進行訓練，大鼠的運動負荷遞增，第7 周開始訓練至力竭。力竭判斷標準，動物跟不上預定速度，大鼠臀部壓在籠具后壁，后肢隨轉動皮帶后拖達30 s，連續的光、聲、機械刺激驅趕無效;行為特征表現為呼吸深急、幅度大，精神疲憊，俯臥位垂頭，刺激后無反應［6－7］。具體的跑臺訓練負荷見表1。

表1 大鼠遞增運動負荷的訓練計劃

1.5 血液指標檢測

分別在大鼠訓練1 周、3 周、9 周后36 小時眼眶后靜脈叢取血，經過9 周遞增負荷模型運動后，恢復一周，在第10 周對大鼠腹腔注射1%的戊巴比妥(1 ml/100g 體重)麻醉，使用肝素真空采血針抽取腹主靜脈血。取血0.2 ml 置于含抗凝劑的EP 管內，檢測全血白細胞(WBC)、血紅蛋白(Hb);取血1 ml 置于試管內，經過3 500 rpm 離心15 min 后取血清，檢測肌酸激酶(CK)、血清尿素氮(BUN)、睪酮(T)等指標。

1.6 Real－time PCR 檢測mRNA 水平表達情況

應用Invitrogen 試劑盒提取T 淋巴細胞總RNA，反轉錄成cDNA，放在－20°C 備用。應用Primer Premier 5.0 軟件設計引物引物由上海生工生物工程公司合成:GAPDH 上游引物5，－CCCTCAATGACCACTTTGTG－3，GAPDH 下游引物5，－GGTTTGAGGGCTCTTACTCC T－3，T－bet 上游引物:5，－CCTGCTGGACGACAATG G－3，T－bet 下游引物:5，TCTGGTAGGCGGTGACTG－3，GATA－3 上游引物:5，－AAGAGTGCCTCAAGTA TCAG－3，GATA－3 下游引物:5，GCGGATAGGTGGT AATGG－3。

2 實驗結果

2.1 白細胞的變化情況

白細胞是一種含有多種細胞功能活性的細胞，它能保護機體免受病原微生物的侵害，常作為觀察運動員免疫作用的有效指標，在運動、寒冷及炎癥等，白細胞數量會明顯增加。9 周運動大鼠空白對照組、運動對照組、金針菇組，在運動第1 周、第3 周、第9 周、第10 周后白細胞的變化見表2。第3 周，運動模型組和金針菇組數據顯示白細胞在運動后出現一過性增高。運動模型組第9 周比空白對照組白細胞顯著降低(P＜0.01)，比第1 周、第3 周白細胞降低(P ＜0.05)，第10 周下降更大。金針菇組第9 周和第10 周白細胞水平和空白對照沒有差異，但是和運動模型組顯著升高。通過實驗可以看到金針菇具有良好維持白細胞水平的作用，起到提高機體免疫力的效果。

表2 各組大鼠白細胞變化(*109 個/L)

2.2 血紅蛋白變化情況

血紅蛋白是運動強度和運動量常用測試指標。9周運動大鼠空白對照組、運動對照組、金針菇組在運動第1 周、第3 周、第9 周、第10 周后血紅蛋白的變化見表3。結果表明運動對照組在第9 周、第10 周時血紅蛋白顯著降低(P ＜0.01)，金針菇組在第9 周時血紅蛋白也有顯著下降(P ＜0.01)，但是比運動模型組有顯著提高(P ＜0.01)。金針菇組在第10 周時血紅蛋白比空白對照組降低(P ＜0.05)，但是比運動模型組有顯著提高(P ＜0.01)。由此可見，金針菇能顯著提高運動疲勞后的血紅蛋白水平。

表3 各組大鼠血紅蛋白變化(g/L)

2.3 肌酸激酶變化情況

9 周運動大鼠空白對照組、運動對照組、金針菇組在運動第1 周、第3 周、第9 周、第10 周后肌酸激酶的變化見表4。運動對照組在第9 周時肌酸激酶比第3周顯著升高(P ＜0.05)，比起空白對照組顯著升高(P＜0.01)，提示有運動疲勞產生。金針菇組第九周肌酸激酶和空白對照組沒有顯著性差異，比運動模型組顯著降低(P ＜0.01)。空白對照組、運動對照組、金針菇組3 組第10 周比第1 周、第3 周、第9 周具有降低(P ＜0.05)，而且金針菇組比空白對照組有顯著降低(P ＜0.01)，比運動模型組有降低(P ＜0.05)。通過以上實驗結果分析金針菇具有顯著降低肌酸激酶、降低疲勞的作用。

表4 各組大鼠肌酸激酶變化(u/l)

2.4 尿素氮變化情況

尿素氮可以作為反映機體疲勞程度和機能狀態的重要指標。空白對照組、運動對照組、金針菇組在運動第1 周、第3 周、第9 周、第10 周后的變化見表5。運動對照組在第3、第9 周時比空白對照組尿素氮顯著升高(P ＜0.01)，提示有運動疲勞產生。金針菇組比運動對照組在第3 周、第9 周、第10 周時均能顯著降低尿素氮(P ＜0.01)，表明金針菇組具有明顯的幫助消除疲勞，促進機體恢復的作用。

表5 各組大鼠尿素氮變化(mmol/L)

2.5 睪酮變化情況

測定血清睪酮值對于評價訓練負荷及機能狀態，有著重要的意義。空白對照組、運動對照組、金針菇組在運動第1 周、第3 周、第9 周、第10 周后的變化見表6。運動對照組在第9 周時睪酮顯著降低(P ＜0.01)，提示有運動疲勞產生。金針菇組對比空白對照組在第九周時睪酮數值略有降低，但是比起運動對照組能顯著提高(P ＜0.05)。第10 周時，金針菇組睪酮比起運動對照組有顯著提高(P ＜0.05)。結果表明金針菇提高睪酮值，具有一定的維持機體雄激素代謝水平的作用。

表6 各組大鼠睪酮變化情況(ng/dL)

2.6 T－bet mRNA、GATA－3 mRNA 變化情況

T－bet 和GATA－3 是T 淋巴細胞分化特異性轉錄因子。空白對照組、運動對照組、金針菇組在運動第九周T－bet mRNA、GATA－3 mRNA 變化見表7。通過數據對比可以看到，運動對照組T－bet mRNA 和GATA－3 mRNA 的表達對比空白對照組沒有顯著差異，金針菇組T－bet mRNA 和GATA－3 mRNA 對比空白對照組和運動對照組均有顯著降低(P ＜0.05)。

空白對照組、運動對照組、金針菇組在運動第十周T－bet mRNA、GATA－3 mRNA 變化見表8。通過數據對比可以看到，運動對照組T－bet mRNA 和GATA－3 mRNA 的表達對比空白對照組顯著升高(P ＜0.01)，金針菇組T－bet mRNA 和GATA－3 mRNA 對比運動對照組顯著降低(P ＜0.01)。

表7 過度運動第9 周T－bet mRNA、GATA－3 mRNA 變化情況

通過表7 和表8，金針菇在第9 周和第10 周Tbet mRNA、GATA－3 mRNA 的變化可以看出:金針菇組在第9 周時T－bet mRNA、GATA－3 mRNA 比空白對照組和運動對照組均降低，而第10 周時金針菇組T－bet mRNA、GATA－3 mRNA 比運動對照組顯著降低，但是和空白對照組沒有顯著差異，接近空白對照水平。由此可見，金針菇具有較好的維持T－bet mRNA、GATA－3 mRNA 的接近正常水平的作用，對于維持T淋巴細胞免疫平衡具有重要作用。

表8 過度運動第10 周T－bet mRNA、GATA－3 mRNA 變化情況

3 討論

目前關于Th1/Th2 平衡與相關疾病的聯系已成為醫學界的研究熱點，但是關于運動性免疫抑制與Th1/Th2 免疫平衡之間關系的研究卻非常少。王茹［8］等建立了大鼠脾臟淋巴細胞中Th1/Th2 型淋巴細胞亞群表達的固相酶聯免疫斑點(ELISPOT)技術檢測方案，比較了Th1/Th2 淋巴細胞和CD4+/CD8+在大鼠遞增負荷過度訓練過程中的改變情況，也有一些運動與免疫關系研究進展的綜述［9］，但關于過度運動導致T 淋巴細胞Th1/Th2 失衡與運動性免疫抑制關系的分子機制的報道非常少見。

Th1/Th2 的分化受特異性轉錄因子的調控，轉錄因子T－bet 和GATA－3 在靜息CD4+T 細胞向Th1型和Th2 型細胞分化和發生中起關鍵作用［10］。Tbet 是Th1 細胞分化的特異性轉錄因子，GATA－3 是Th2 細胞分化特異性轉錄因子，調控幼稚CD4+T 細胞向Th2 型分化，可使發育中的Th1 細胞反轉為Th2表型［11］。

T－bet 為轉錄因子T－box 家族成員，可部分通過激活Th1 型標志型細胞因子IFN－γ 的表達使CD4+T 細胞分化為Th1 型細胞［12］。T－bet 的表達與IFNγ 的表達呈正相關，而在Th2 細胞中不表達，將T－bet轉染至完全分化的Th2 細胞核中，能使這些細胞產生IFN－γ 并同時抑制IL－4 和IL－5 生成。T－bet 基因表達的強弱直接影響T 細胞向Th1 或Th2 型的分化，目前已經成為調節Th1/Th2 分化及建立新的免疫平衡的重要靶點。

GATA－3 屬于GATA 轉錄因子家族，特異性表達于Th2 細胞，Agnello 等［13］研究發現，在Th2 細胞中，用染色質免疫沉淀法證明GATA－3 結合于遠側3’端的增強子。實驗表明，GATA－3 可提高IL－4 啟動子的轉錄活性，反義基因抑制這一過程［14］;用逆轉錄病毒載體將GATA－3 轉入成熟的Th1 細胞時不能引起IL－4 生成。GATA－3 促進IL－4 基因表達的具體機制存在爭議。普遍認為GATA－3 通過3 種不同的機制促進Th2 效應［15］:1)促進Th2 細胞因子的生成;2)Th2 細胞選擇性生長;3)抑制Th1 細胞特異性因子。

本實驗中九周過度運動大鼠血紅蛋白顯著降低、肌酸激酶和尿素氮顯著升高，睪酮顯著降低，這些表明過度運動大鼠疲勞程度較高。在大強度訓練(或大運動量訓練)的動物與人體模型中，訓練后T1 細胞的數量和功能均受到抑制，該抑制作用可持續7 天［16］，因此，我們又繼續檢測了運動第十周的各項指標。通過運動1 周、3 周、9 周和10 周后血液指標的檢測得出金針菇能維持良好的白細胞水平，顯著提高過度運動大鼠的血紅蛋白和睪酮，降低肌酸激酶和尿素氮，提高機體免疫力，促進運動疲勞恢復。第10 周時金針菇組T－bet mRNA、GATA－3 mRNA 比運動對照組顯著降低，但是和空白對照組沒有顯著差異，金針菇能較好的維持T－bet mRNA、GATA－3 mRNA 的水平接近正常水平。關于轉錄因子T－bet、GATA－3 在T 淋巴細胞及Th1/Th2 平衡中的作用及具體的機制還需要進一步研究。

4 結論

4.1 金針菇能顯著提高運動疲勞大鼠的白細胞，血紅蛋白和睪酮水平，具有較好的提高運動能力，增強機體免疫力的作用。

4.2 金針菇能顯著降低運動疲勞大鼠肌酸激酶、尿素氮，幫助大鼠在過度運動后消除疲勞，恢復體能。

4.3 金針菇能使運動大鼠第10 周T－bet mRNA、GATA－3 mRNA 接近空白對照水平，對維持Th1/Th2處于平衡狀態起到一定作用。

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