結直腸癌中微衛星不穩定檢測的臨床意義

黃彥欽 沈虹 李墨丹 袁瑛

微衛不穩定(microsatellite instbility，MSI)又稱復制錯誤(replication error，RER)，其意義是腫瘤細胞與同一個體的正常組織細胞DNA相比，腫瘤細胞的基因組DNA中單個、二個、三個或四個核苷酸組成的重復序列長度發生了改變［1-2］。最初的研究認為，MSI是遺傳性非息肉病性結直腸癌(hereditary nonpolyposis colorectal cancer，HNPCC)特征性的分子變化，與人類錯配修復基因(mismatch repair，MMR)的種系突變有關。而后續研究發現一小部分的散發性大腸癌也存在著MSI現象，但這種MSI大都與hMLH1基因的啟動子區高甲基化狀態有關。

目前有兩種方法明確腫瘤的MSI狀態。一種是RER試驗，即設計引物通過PCR的方法擴增微衛星位點，常用的檢測位點是美國國家癌癥研究所(NCI)專家推薦的5個標準位點(BAT26、BAT25、D2S123、D5S346 和 D17S250)。通過正常組織和腫瘤組織的比較，如果2個以上位點存在MSI狀態則認為該患者是高度微衛星不穩定(MSI-high，MSI-H)，即錯配修復功能缺陷(defective MMR，dMMR);如果小于2個位點存在MSI狀態或無一位點存在MSI狀態，則認為該患者是低度微衛星不穩定(MSI-low，MSI-L)或微衛星穩定(microsatellite stability，MSS)，即錯配修復功能完整(proficient MMR，pMMR)。除NCI專家推薦的這五個位點，也可擴增Sargent等［3］推薦的11個微衛星位點，如大于30%的位點陽性則患者為MSI-H，如小于30%的位點陽性則患者為MSI-L，所有位點都陰性則患者為MSS。此方法對實驗室要求較高，很難在基層醫院開展。另一種MSI的檢測方法是采用免疫組織化學法(immunohistochemical staining，IHC)檢測腫瘤組織中hMLH1、hMSH2、hMSH6和hPMS2蛋白的表達，如這四個蛋白均陽性表達，說明該患者為pMMR狀態;如這四個蛋白中任一蛋白為陰性表達，則患者為dMMR狀態。此方法相對簡單易行，對實驗室要求較低，成本也較低，容易在基層醫院的病理科開展實施。

美國癌癥綜合網絡(NCCN)的結直腸癌指南中明確指出小于50歲的患者和所有的II期結直腸癌患者在術后選擇輔助化療前，均需明確腫瘤的MSI狀態。筆者就從這兩個方面對MSI因素在結直腸癌患者中的臨床意義做一闡述。

一、檢測MSI狀態明確小于50歲結直腸癌患者的遺傳背景

已有研究表明約三分之一結直腸癌的發生與遺傳相關，這其中又以HNPCC最為常見，約占所有結直腸癌的1% ～5%。MSI現象是HNPCC的一個重要特征。錯配修復基因遺傳性缺陷是HNPCC的病因，而MSI現象正是這些錯配修復基因缺陷在基因組上的表現。但是，并不是所有MSI結直腸癌都是HNPCC。有MSI表現的結直腸癌約占所有結直腸癌的15%，而HNPCC只占到其中的3% ～5%，其余的10%～12%是由結直腸癌體細胞hMLH1基因甲基化導致的［4］。同樣，并不是有明顯家族聚集現象的結直腸癌都會有MSI表現。臨床上與HNPCC完全相符的家族聚集性結直腸癌無MSI表現者可達20%以上，這種家族聚集結直腸癌被稱作癌家族X綜合癥［5］。因此，可以說MSI表現與HNPCC是同一原因引起的兩種不同表象。

從理論上講，MSI因素可能包含著HNPCC的發病機制。MMR基因缺陷導致基因組不穩定，DNA在復制過程中錯配概率增加，突變積累，最后引發癌癥。這是一個看上去比較合理的假設。但是，我們在HNPCC腫瘤組織上發現的MSI狀態絕大部分并不在基因的外顯子區域，而往往在內含子區或基因之間的區域。1997年NCI專家制定了判定MSI狀態的標準，即將 BAT25，BAT26，D5S346，D2S123，D17S150 等 5個微衛星位點作為不穩定程度的標準［6］，有2個及2個以上位點不穩定者為MSI-H，但這些位點并不在基因的重要區域。目前已知的HNPCC相關MSI位點中，體細胞TGFBRII基因上的MSI位點可能與結直腸癌發病機制密切相關［7］，遺傳性TGFBRI基因6A微衛星序列可能與結直腸癌易感性相關，但這方面的研究尚未有進一步突破。

MSI和HNPCC均由MMR基因缺陷引起，但不同的MMR基因或不同的MMR基因突變方式引起的結直腸癌似乎并不相同。MMR基因在人類基因組中多達12個，但目前已知與HNPCC的發生有關的僅有4個(hMLH1，hMSH2，hMSH6和hPMS2)。最近，有專家認為一個與hMSH2相關的EPCAM基因突變可能也是HNPCC的致病因素［8］。這些基因遺傳性突變的頻率和產生腫瘤的類型均有不同，hMSH2和hMLH1占到所有突變的90%以上，其產生的腫瘤大多為結直腸癌，hMSH6突變約占6%，其突變者中子宮內膜癌患病率明顯高于其他基因突變者［9］。同樣是hMLH1基因變異的結直腸癌，hMLH1啟動子甲基化引起者與hMLH1遺傳性突變者的結直腸癌生物學特性也存在差異，前者對5-氟尿嘧啶的化療不敏感，而后者則相對較敏感［10］。在這些MMR基因突變的結直腸癌中，MSI表現則較為一致，BAT25、BAT26等單核苷酸重復序列的不穩定仍然是最常見的MSI現象。

由于幾乎所有已證實存在MMR基因突變的HNPCC組織中均存在MSI現象，因此對所有臨床確診的結直腸癌患者檢測MSI狀態，發現MSI-H者在排除hMLH1甲基化的原因后同時檢測患者外周血中MMR基因的遺傳性突變，可篩選出HNPCC患者，但單獨采用檢測MSI狀態方法篩選HNPCC患者可能不是一種經濟的方法［11］。結直腸癌組織MMR蛋白的IHC檢測也有相同的作用［12］，將MSI檢測與IHC檢測聯合應用則有較好的成本效果比［11］。在利用檢測MSI狀態方法篩選HNPCC的過程中，當篩查發現MSI-H者，還需將遺傳突變引起的MSI狀態與體細胞hMLH1基因突變引起的MSI狀態做鑒別，此時用BRAF基因上V600E突變位點做排除篩選是一個非常有效的方法，因為凡是有BRAF基因突變者均不是HNPCC。應用上述方法對所有結直腸癌患者進行篩查，可發現其中3．6%的患者為 HNPCC［13］。由于 MSI-H結直腸癌的發病年齡較早，椐 Mecklin等［14］的報導，在HNPCC家系表中中，80%的大腸腫瘤發生在50歲以前，12%發生在39歲以下，而1%發生在70歲以上，因此，推薦對發病年齡小于50歲的患者常規進行MSI的檢測，以明確其遺傳背景。

二、檢測MSI狀態指導II期結直腸癌患者術后的輔助治療

對于散發性結直腸癌而言，MSI狀態首先是一個預后相關標記。大量回顧性研究的結果提示，無論是在II期患者還是III期結直腸癌患者中，MSI-H的錯配修復功能缺陷(dMMR)的結直腸癌患者往往能夠獲得更好的預后［15-19］。2005年發表在JCO上的一項薈萃分析結果也證實了這一觀點［20］。Sargent等［3］對507 例患者進行了 MSI狀態檢測，發現II期結直腸癌組織分化程度差患者中dMMR比例明顯高于其他類型。單因素分析的結果顯示，在只接受手術治療而未行術后輔助化療的患者中，dMMR(MSI-H)組的無復發生存(disease-free survival，DFS)明顯優于pMMR組，這些結果提示MSI狀態對患者而言是一項有意義的預后因素。雖然這一結論尚未被多因素分析所證實，但在單因素分析中較高的HR值仍提示其對患者的預后起到了較強的保護作用。研究提示這種保護作用可能與MSI-H狀態下腫瘤VEGF表達水平及微血管密度有關［21-22］。

MSI狀態除了能夠作為結直腸癌患者術后生存的預后因子外，研究還顯示MSI狀態對5-氟尿嘧啶在結直腸癌患者中的療效預測上也存在著一定的意義。20世紀90年代起，以5氟尿嘧啶(5-FU)和亞葉酸鈣為主的化療方案成為了III期大腸癌患者以及部分II期高危大腸癌患者的術后標準輔助化療方案［23-26］。目前，國際上關于III期大腸癌患者常規接受含5-氟尿嘧啶類藥物的方案化療已經達成共識。然而，是否應該對II期大腸癌進行術后常規輔助化療仍然存在爭議。部分臨床試驗的結果顯示，在接受輔助化療的II期大腸癌患者中只有約3%的患者生存期得到了提高［27-28］，而從已有的研究結果來看，這些患者似乎并未從含5-氟尿嘧啶的化療方案中獲益。也正因為如此，2004年美國臨床腫瘤學會提出:不推薦在II期結腸癌患者中進行常規術后輔助化療。

由于II期大腸癌具有與其他期結直腸癌所不同的臨床特征和分子表現(MMR缺失和MSI高發生率)，人們開始關注5-氟尿嘧啶療效是否與II期大腸癌與眾不同的分子特征存在關聯性。Ribic等［29］首先提出了dMMR的腫瘤無法從5-氟尿嘧啶化療中獲益的假說。目前許多關于MMR與化療療效的研究結果也支持這一觀點。一項體外實驗的結果顯示，hMLH1缺失的細胞系會對5-氟尿嘧啶產生抗藥性，這一抗藥性通常是由hMLH1啟動子甲基化所引起的。實驗同時也提示hMLH1缺失狀態可以被去甲基物質5氮胞苷所逆轉。而另一項異種移植實驗也證實了伴MSI現象的大腸癌存在對5-氟尿嘧啶的抗藥性［29］。Sargent等對457例結直腸癌患者進行MSI狀態檢測及隨訪后發現，無論術后病理分期是II期還是III期，接受5-氟尿嘧啶化療并不能改善dMMR患者的DFS和OS，尤其對于dMMR的II期大腸癌患者而言，5-氟尿嘧啶輔助化療反而會降低OS。

由于dMMR結直腸癌患者相對pMMR患者預后相對更佳，因此dMMR患者不接受術后輔助化療也是一種可選擇的治療策略。美國胃腸協作組正在進行的E5202試驗，將II期結直腸癌患者按照手術前MSI狀態以及染色體18q的雜合性缺失情況分為高風險組和低風險組進行輔助化療或觀察隨訪，這個研究結果將進一步明確MSI及18qLOH對II期腸癌預后的影響［30］。而由于dMMR或MSI-H狀態的II期結直腸癌并不能夠從5-FU的術后化療中獲益，因此不推薦對這些患者進行5-FU的術后化療，這樣也可以避免治療相關的毒性、花費以及化療所引起的生活質量的下降。值得注意的是，雖然在Sargent等人的研究中提示pMMR狀態的II期結直腸癌患者在接受了5-氟尿嘧啶化療后在DFS和OS上均有獲益，但現有的證據并不支持將pMMR作為II期患者術后輔助化療的高危因素。目前公認的臨床高危因素仍是腫瘤分期為T4、穿孔、腸梗阻、腫瘤分化程度差、存在血管浸潤及清掃淋巴結數目小于12枚［31］。

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