AC133抗原聯合EpCAM識別轉移性結直腸癌干細胞的研究

杜航向 楊治力 楊逸 盛能全 王志剛

結直腸癌是全球高發的消化系統惡性腫瘤，其發病率不斷上升，在中國腫瘤死因中占第4位［1］。盡管結直腸癌的診療水平不斷提高，但術后復發率高，五年生存率低。腫瘤干細胞是腫瘤細胞中具有自我更新和多向分化能力的細胞亞群，在腫瘤中所占比例很小［2］，被認為是腫瘤耐藥、復發和轉移的根源［3-6］。

腫瘤干細胞表面標志分子是存在于腫瘤細胞表面的特異性蛋白分子，是腫瘤干細胞的身份象征，可被用來篩選腫瘤干細胞。最初AC133抗原被發現選擇性表達在人類胚胎的肝、骨髓、臍血及外周血CD+34造血細胞中［7］，隨著研究進展，在干細胞表面也發現有AC133抗原的表達。目前該抗原已被認為是一個嶄新的、極有研究和應用價值的干細胞表面標志。

最近，結直腸癌中也發現了上皮細胞粘附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)陽性的可疑腫瘤干細胞［8］。EpCAM是由GA-733-2基因編碼的相對分子質量為40 000的糖蛋白，表達在人類大多數上皮細胞的基底側，是最早被發現的腫瘤標志物之一。

腫瘤干細胞理論的提出及證實［9-11］，為惡性腫瘤的診斷和治療提供了新思路。近年來，腫瘤干細胞學說是腫瘤生物學領域非常重要的研究進展，該理論不但提供了腫瘤生成的可能原因，更解釋了腫瘤產生抗藥性導致難以治愈的可能原因。因此，對于各種腫瘤干細胞的鑒定及相關生物學理論的研究成為當前研究的熱點［12-15］。

本研究嘗試以EpCAM和AC133為腫瘤干細胞表面標記，對結直腸癌細胞進行標記后以流式細胞儀進行分選，從結直腸癌組織中分離出 AC133+EpCAM+結直腸癌干細胞，并對其進行生物學鑒定，以期為結直腸癌干細胞的功能研究奠定基礎。

資料與方法

一、一般資料

50例結腸腺癌組織標本取自上海市第六人民醫院普外科2012年6月至8月間接收手術治療的結腸癌患者。其中，男性33例，女性17例;年齡41～83歲(中位年齡62歲)。術中冰凍切片及術后病理切片均證實為腺癌組織。術前術后未經過任何化療藥物干擾。組織獲取均經過患者同意，并通過醫學倫理委員會批準。

二、方法

1．主要試劑:藻紅蛋白(PE)標記的AC133單抗(德國 Miltenyi Bio-tec公司)，異硫氰酸熒光素(FITC)標記的 EpCAM抗體(美國 Ebioscience公司)，DMEM/F12培養基(美國Hyclone公司)，堿性成纖維生長因子(bFGF)、表皮生長因子(EGF)(美國 Peprotech公司)，DMEM細胞培養基(美國GIBCO公司)。

2．實驗動物:Balb/C裸鼠30只均購自上海實驗動物中心，4～6周齡，體重15～20 g，雌雄不限，在無特殊病原體動物飼養室喂養。常規飼料喂飼和飲水。

3．腫瘤組織取材:取新鮮結腸癌患者手術后標本，0．9%生理鹽水沖洗后切取腫瘤邊緣約1 cm×2 cm大小的非壞死組織。用清洗液(青霉素1 mg/ml、卡那霉素 0．5 mg/ml、兩性霉素 2．5 ug/ml的生理鹽水)清洗癌組織5次，4℃保存液中保存備用。

4．原代結腸癌細胞提取:在無菌條件下，用細胞清洗液清洗腫瘤組織3次，將其剪碎后用9 ml清洗液清洗后收集到50 ml離心管中，加入0．25%分散酶 1．5 ml、0．4% 膠原酶 0．5 ml胎牛血清(FSC)50 ul，放入37℃培養箱中振蕩消化1 h。離心后用60目篩網過濾，收集，再次離心后的組織與10 ml培養液混勻后放入25 cm2細胞培養瓶中過夜培養。第二天將上清懸浮細胞吸除，保留貼壁活性細胞。胰酶消化后用120目篩網過濾，計數后備用。

5．流式細胞術分選:取上述制備好的單細胞懸液1×106個/ml，加入20 ul PE標記的AC133抗體、80 ul FITC標記的 EpCAM抗體，4℃避光孵育30 min，用PBS漂洗后，用流式細胞儀分選AC133+EpCAM+細胞和AC133-EpCAM-細胞，收集待用，采用WinMDI 2．9軟件分析流式細胞儀數據。

6．細胞的體外培養和形態觀察:將 AC133+EpCAM+細胞和AC133-EpCAM-細胞在無血清培養基上進行傳代培養，用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態變化及生長狀況并拍照。

7．體外克隆形成實驗:取對數生長期AC133+EpCAM+細胞和 AC133-EpCAM-細胞，0．25% 胰酶消化并吹打成為單細胞，用含20%胎牛血清的DMEM培養液調整細胞密度至1×106個/L，然后根據實驗要求作梯度倍數稀釋;用蒸餾水分別制備出1．2%和0．7%兩個濃度的低熔點瓊脂糖液，高壓滅菌，維持在40℃確保不凝;按1:1比例使1．2%的瓊脂糖液和2×DMEM培養基(含2×抗生素和20%小牛血清)混勻后，取3 ml混合液注入到直徑6 cm的平皿中，冷卻凝固，待用;按1:1比例使0．7%的瓊脂糖液和2×DMEM培養基在無菌試管中混勻，再向管中加入0．2 ml的細胞懸液，充分混勻，注入待用的平皿中，形成雙瓊脂層，待上層瓊脂凝固后，置于37℃ 5%CO2培養箱中培養10～14 d;把平皿放在倒置顯微鏡下，觀察細胞克隆數，計算形成率。

8．多細胞球培養:取對數生長期的 AC133+EpCAM+細胞和 AC133-EpCAM-細胞，0．25% 胰酶消化后輕輕吹打，使之成為單細胞，用無血清培養基重懸，計數后，以小于104/ml密度接種至無血清培養基中進行常規培養;細胞培養液加入至T25或更小的玻璃培養瓶中，豎直放入培養箱培養，每2～3天半量換液，每6～8天傳代一次;傳代時離心收集微球體，重懸于胰酶替代品Accutase液中，37℃消化5～10 min，吹打數次至使之成為單細胞，離心洗滌后計數，種至無血清培養基中進行傳代培養。

9．裸鼠成瘤實驗:在裸鼠腋下將處于對數生長期的AC133+EpCAM+細胞和 AC133-EpCAM-細胞及其微球體細胞分別以3 ×103、3 ×104、3 ×105皮下接種，每3天觀察一次腫瘤形成情況，連續觀察4周后，處死小鼠取出腫瘤組織并測量其大小。

10．Transwell腫瘤細胞侵襲實驗:將無血清培養液和Matrigel膠按2．5:1的比例混合均勻后包被到Transwell小室底部;取對數生長期的 AC133+EpCAM+細胞和AC133-EpCAM-細胞及其微球體細胞制備成單細胞懸液，將細胞濃度調整至1×104，加至小室，用含1%FBS的DMEM培養基培養;小室外加入含10%FBS的DMEM培養基;每組細胞重復3次，常規培養48 h后取出小室，擦去微孔膜上層細胞后，蘇木素染色，顯微鏡觀察微孔膜下層的細胞并計數;計算相對侵襲指數(V2/V1，其中 V1代表AC133+EpCAM+細胞或AC133-EpCAM-細胞的穿膜數，V2代表其微球體細胞的穿膜數)。

11．CCK-8法檢測體外增殖力:AC133+EpCAM+及AC133-EpCAM-組細胞重懸于含EGF及bFGF的ATCC中，稀釋為1x104/ml，以每孔200 uL接種于96孔板．共設1個空白對照組(無細胞的ATCC)和7個測定組。將接種好的96孔板進行培養，每間隔24 h以CCK-8法測定。以空白對照組調零，用酶聯免疫檢測儀于450 nm處測定各孔吸光度值，每種細胞每次測定3孔，取其平均值。以培養天數為橫坐標，平均吸光度值為縱坐標，描繪細胞生長曲線。

三、統計學方法

采用SPSS11．0統計學軟件進行數據分析，兩組間比較采用t檢驗，以P＜0．05為差異有統計學意義。

結 果

1．AC133+EpCAM+細胞較 AC133-EpCAM-細胞表現出更好的折光性，細胞團直徑更大，密度更高(圖1)。

圖1 AC133+EpCAM+細胞和AC133-EpCAM-細胞體外培養倒置相差顯微鏡觀察圖像

2．AC133+EpCAM+細胞和 AC133-EpCAM-細胞克隆形成實驗結果:AC133+EpCAM+細胞和AC133-EpCAM-細胞在相同條件下前者較后者形成了更多的克隆細胞團，直徑更大，密度更高(圖2)。

3．AC133+EpCAM+細胞和 AC133-EpCAM-細胞微球體形成情況:培養24 h的細胞呈懸浮狀態，有較小的細胞團塊出現;3 d后可見大部分細胞呈碎渣樣死亡，少數細胞成團長大，形態規則;6～8 d后可見到由數十到數百個細胞組成較大的圓形或卵圓形細胞微球體，致密均一，折光性良好，懸浮生長。傳代培養后可見微球體的形成增多且形態趨于圓形(圖3)。

4．裸鼠成瘤實驗結果:AC133+EpCAM+結直腸癌干細胞具有很強致瘤性，100個AC133+EpCAM+結腸癌干細胞就能形成移植瘤，隨著細胞數目的增多，成瘤率逐漸增高，腫瘤的直徑增大;而AC133-EpCAM-細胞的成瘤能力相對很弱(圖4，表1)。

圖2 AC133+EpCAM+細胞和AC133-EpCAM-細胞克隆形成實驗平皿在倒置顯微鏡下觀察圖像

圖3 AC133+EpCAM+細胞和AC133-EpCAM-細胞經多細胞球培養后倒置相差顯微鏡下觀察圖像

圖4 接種AC133+EpCAM+細胞和AC133－EpCAM－細胞的裸鼠腫瘤標本圖像

5．AC133+EpCAM+細胞和 AC133-EpCAM-細胞及其微球體的侵襲能力(圖5):從圖中可知，AC133+EpCAM+細胞表現出最強的侵襲能力，AC133-EpCAM-細胞最弱。

6．體外增殖能力檢測:利用 CCK-8法檢測AC133+EpCAM+和AC133-EpCAM-細胞體外增殖能力并繪制細胞生長曲線。AC133+EpCAM+組較AC133-EpCAM-組生長迅速．AC133+EpCAM+組細胞群體倍增時間為(20±2)h，而AC133-EpCAM-組細胞群體倍增時間為(42±5)h．兩者比較差異有統計學意義(P ＜0．05，圖6)。

討 論

目前研究表明，只有極小部分腫瘤干細胞具有成瘤能力，且成瘤率較高［16-19］。如何找到一種簡單有效的方法，準確地確定這類干細胞，一直是科學家不斷探索的課題。由于腫瘤干細胞是無特異生理功能的未分化細胞，因此檢測其特異性表面標記就成為一種分選與鑒定干細胞的重要方法。

圖5 AC133+EpCAM+細胞和AC133-EpCAM-細胞及其微球體微孔膜下層顯微鏡觀察圖像

表1 Balb-C裸鼠成瘤率的比較

圖6 AC133+EpCAM+細胞和 AC133－EpCAM－細胞體外增殖能力生長曲線圖

自我更新是干細胞的重要特性，體外培養的細胞常用克隆形成實驗來檢測干細胞的自我更新能力。腫瘤干細胞能在無血清添加的重組表皮生長因子和堿性成纖維生長因子培養基中懸浮生長，形成“細胞球”樣結構，并且具有無限增殖的潛能，可在體外連續傳代并不影響細胞球的結構。這種細胞球可反映實體腫瘤的立體生長方式和組織結構，并且可準確模仿腫瘤內的細胞間聯系和微環境條件，特別是營養和氧濃度梯度［20］。2007 年，O’Brien等［21］首先報道了結直腸癌腫瘤干細胞存在于CD133+細胞群中，CD133+細胞群除了能在體外無血清培養基中以未分化腫瘤細胞球的形式快速增長，還能在免疫缺陷小鼠體內連續成瘤。因此，腫瘤干細胞能在無血清培養基中生長并形成細胞球是自我更新能力的體現。本實驗中，EpCAM+AC133+細胞能在無血清培養基中懸浮生長，3周后能形成均勻一致的細胞球。而且在血清誘導下，結直腸癌干細胞標志物 AC133、EpCAM的表達逐漸減少，EpCAM+AC133+細胞比例逐漸下降，培養7 d后，失去懸浮生長能力，貼壁生長，表明其在體外培養后，產生了不同表型的子代細胞，僅一部分細胞保持了與母代細胞相似的表型和特性，這一部分細胞在干細胞培養條件下仍然具有形成克隆的能力，表明EpCAM+AC133+細胞在體外培養時仍具有分化與自我更新的能力。

腫瘤干細胞有表達干細胞相關標志、啟動腫瘤發生和腫瘤形成的能力。Oliver等［22］認為僅需一個腫瘤細胞就能在體內復制出其來源組織的腫瘤。Al-Hajj等［23］證明只需100個表面抗原為 CD44+CD24-的乳腺癌細胞即可在NOD/SCID鼠體內形成移植瘤。這種能力與腫瘤干細胞自我更新分化及增殖能力有關，也是鑒定腫瘤干細胞最重要的環節。在本實驗中，我們將分選后的EpCAM+AC133+細胞與EpCAM-AC133-細胞以不同濃度分別接種于NOD/SCID小鼠皮下觀察其形成移植瘤的能力，以評價其致瘤性的差異。結果發現EpCAM+AC133+細胞的體內成瘤能力明顯強于EpCAM-AC133-細胞(P＜0．01)，即使接種數少至100個細胞，也有40%的成瘤率，但成瘤時間較長，腫瘤也較小，接種數為5 000個細胞時則全部成瘤，成瘤時間明顯縮短，瘤體較大，而EpCAM-AC133-細胞即使接種數為10 000個細胞也不能成瘤。另外，EpCAM+AC133+細胞的成瘤能力也強于未分選的細胞，即使接種10 000個未分選細胞，也僅有20%的成瘤率，低于接種100個EpCAM+AC133+細胞的成瘤率(40%)，接說明腫瘤干細胞的比例是很低的。這顯示EpCAM+AC133+有較強的致瘤能力，是結直腸癌的主要致瘤細胞，具有腫瘤干細胞的特性。

AC133是乳腺癌、腦膠質瘤、肝癌、前列腺癌等多種實體瘤的腫瘤干細胞標記物［24-25］。通過對CD133+結直腸癌細胞的分選和體外擴增，我們發現體外擴增的CD133+結直腸癌細胞具有類似神經干細胞球的生長特性，并有多向分化及自我更新能力;更為重要的是AC133+結直腸癌細胞較AC133-結直腸癌細胞具有更強的致瘤能力。該研究為AC133作為結直腸癌干細胞標記物提供了實驗依據。為了使分選的結直腸腺癌干細胞更加純凈，我們在實驗中增加了特異性的EpCAM分子作為分選標記，而且在實驗中驗證了AC133陽性細胞同時表達EpCAM分子。

腫瘤的侵襲和轉移是臨床上腫瘤得不到根治的一個重要原因，它是腫瘤細胞和宿主細胞、細胞外基質之間一系列復雜的、多步驟、多因素影響的過程，侵襲是整個過程的關鍵環節。本實驗結果表明干細胞球的黏附性和侵襲性明顯強于親本細胞，從而解釋了為什么腫瘤干細胞會成為腫瘤復發和轉移的根源。

通過本研究不僅對人結直腸腺癌干細胞的鑒定和流式分選建立了技術平臺，更重要的是為后續研究人結直腸癌干細胞的相關生物學特性提供了實驗基礎。

［1］ 張秋菊，劉斌，邢傳平．結直腸癌干細胞的研究與進展．中國組織工程研究與臨床康復，2008，12(8):1529-1532．

［2］ Kitamura N，Koshiba M，Hode O，et al．Expression of granulysin mRNA in the human megakaryoblastic leukemia cells line CMK．Aeta Haematoi，2002，108(1):13-18．

［3］ Huang EH，Heidt DG，Li CW，et a1．Cancer stenl cell:a new paradigm for understanding tumor pmgmssion and therapeutic resistance．Surgery，2007，141(4):415-419．

［4］ Spillane JB，Henderson MA．Cancer stenl celia:a review．ANZ J Surgery，2007，77(6):464-468．

［5］ Jordan CT．The leukemic stem cell．Best Pratt Res Clin Haematol，2007，20(1):13-18．

［6］ Li F，Tiede B，MassaguéJ，et al．Beyond tumorigenesis:cancer stem cells in metastasis．Cell Res，2007，17(1):13-14．

［7］ Yin AH，Miraglia S，Zanjani ED，et al．AC133，a novel marker for human hematopoietic stem and progenitor cells．Blood，1997，90(12):5002-5012．

［8］ Rajaraman R，Guernsey DL，Rajaraman MM，et al．Stem cells，senescence，neosis and self-renewal in cancer．Cancer Cell Int，2006，6:25．

［9］ Stingl J，Caldas C．Molecular heterogeneity of breast carcinomas and the cancer stem cell hypothesis．Nat Rev Cancer，2007，7(10):791-799．

［10］ Ichim CV，Wells RA．First among equals:the cancer cell hierarchy．Leuk Lymphoma，2006，47(10):2017-2027．

［11］ Thiery JP，Sastre-Garau X，Vincent-Salomon B，et al．Challenges in the stratification of breast tumors for tailored therapies．Bull Cancer，2006，93(8):81-89．

［12］ Zhang M，Rosen J M．Stem cells in the etiology and treatment of cancer．Curr Opin Genet Dev，2006，16:60-64．

［13］ Griffit hs M J，Bonnet D，Janes SM．Stem cells of the alveolarepit helium．Lancet，2005，366:249-260．

［14］ Kim CF，J ackson EL，Woolfenden AE，et al．Identification of bronchioal veolar stem cells in normal lung and lung cancer．Cell，2005，121:823-835．

［15］ Dong J，Kislinger T，Jurisica I，et al．Lung cancer:developmental networks gone awry．Cancer Biol Ther，2009，8:312-318．

［16］ Stingl J，Caldas C．Molecular heterogeneity of breast carcinomas and the cancer stem cell hypothesis．Nat Rev Cancer，2007，7(10):791-799．

［17］ Yi L，Zhou ZH，Ping YF，et al．Isolation and characterization of stem cell-like precursor cells from primary human anaplastic oligoastrocytoma．Mod Pathol，2007，20(10):1061-1068．

［18］ Rajaraman R，Guernsey DL，Rajaraman MM，et al．Stem cells，senescence，neosis and self-renewal in cancer．Cancer Cell Int，2006，6:25．

［19］ Ichim CV，Wells RA．First among equals:the cancer cell hierarchy．Leuk Lymphoma，2006，47(10):2017-2027．

［20］ Weilwald LB，Guinebretiere JM，Richon S，et al．In situ protein expression in tumor spheres:development of an immunostaining protocol for confocal microscopy．BMC Cancer，2010，10:106-118．

［21］ O’Brien CA，Pollett A，Gallinger S，et al．A human colon cancer cell capable of initiating tumor growth in immuno-deficient mice．Nature，2007，445(7123):106-110．

［22］ Oliver TG，Wechsler-Reya Rj．Getting at the root and stem of brain tumors．Neuron，2004，42(6):885-888．

［23］ Cheng H，Leblond CP．Origin，differentiation and renewal of the four main epithelial cell types in the origin of the mouse small intestine．V．Unitarian the theory of the origin of the four epithelial cell types．Am J Anat，1974，141:537-561．

［24］ Ricci-Vitiani L，Lombardi DG，Pilozzi E，et al．Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells．Nature，2007，445:111-115．

［25］ Singh SK，Hawkins C，Clarke ID，et al．Identification of human brain tumour initiating cells．Nature，2004，432:396-401．

杜航向，楊治力，楊逸，等．AC133抗原聯合EpCAM識別轉移性結直腸癌干細胞的研究［J/CD］．中華結直腸疾病電子雜志，2013，2(4):170-176．