miRNA-30在腫瘤細胞中的作用

張騫 王錫山

microRNA(miRNAs)是一種長度約為22核苷酸的非編碼的單鏈小RNA，由內源基因編碼，主要功能是負性調節靶基因的表達。從1993年 Lee和 Ambros［1］在 C．elegans中發現lin-4以來，至今發現的miRNAs已經超過1 000種。成熟的miRNAs分子的形成過程包含若干個步驟:miRNAs基因通過RNA聚合酶Ⅱ轉錄合成原始microRNA(primicroRNA)，pri-microRNA 具有5’端的帽子、3’端的polyA 尾的結構;pri-microRNA經過兩次酶的剪切產生成熟的miRNAs。動物 pri-microRNA第一次剪切在細胞核內，經Dorsha酶剪切產生大小約70個核苷酸并形成莖環結構的microRNA前體(pre-microRNA);pre-microRNA通過Ran-GTP依賴性核漿轉運子Exportin5從核內轉移至細胞質中。在細胞質中，Dicer酶將pre-microRNA剪切形成一個不完全配對的雙鏈RNA片段即microRNA和microRNA*雙體，其中一條形成成熟的21～23個核苷酸長度的microRNA分子，另一條則可能迅速降解。成熟的microRNA形成RNA誘導復合體(RNA-induced silencing complex，RISC)，從而引起靶基因mRNA降解或翻譯抑制。miRNA與靶基因的mRNA 3’端非翻譯區(3’-UTR)完全或部分結合，使得mRNA降解或抑制翻譯產物的生成，從而參與調控個體發育、細胞凋亡、增殖及分化。目前報道的miRNAs靶基因大約有5300個。一個miRNA可以與多個mRNA結合，而一個mRNA可以同時被多個miRNAs調節，據統計約30%的基因受到 miRNA的調節。

腫瘤是由細胞增殖和損傷細胞存活引起的。細胞本身有多種機制，調控細胞正常的分裂、分化和死亡。通過一系列基因的活化或沉默精確地調節細胞增殖和分化。在腫瘤細胞當中，可以選擇性的開啟或關閉某些癌基因、抑癌基因的功能。大部分癌基因和抑癌基因首先由DNA轉錄成RNA，然后再翻譯成相應的蛋白，從而發揮對應的生物學功能。而miRNAs可以通過與靶mRNA結合，來發揮類似于“抑癌因子”和“促癌因子”的功能。miRNA-30家族作為miRNA s的重要組成部分，在人類和動物miRNA的功能研究中起著不容忽視的作用。miRNA-30包括miR-30a、miR-30b、miR-30c、miR-30d 和 miR-30e。這五個 miRNAs可以分為三簇:miR-30a和 miR-30c-2，miR-30d和 miR-30b，miR-30e和 miR-30c-1［2］。

一、肝癌

肝細胞癌(hepatocute carcinoma，HCC)是世界范圍內最常見的惡性腫瘤之一，尤其在東亞和南非地區是首要致死疾病。miRNA-30通過與靶基因作用可以影響HCC細胞的增殖、侵襲、轉移。Yao等［3］通過 qRT-PCR方法檢測到 miR-30d在HCC細胞中表達上調，Transwells實驗表明miR-30d可以促進體外HCC細胞的轉移和侵襲能力，體內實驗表明miR-30d可以促進HCC肝內和肺轉移。結合生物信息學方法和構建熒光素酶載體等，證實Galphai2(GNAI2)為其靶基因。并且Galphai2(GNAI2)在HCC細胞中表達下調，且具有抑制HCC細胞轉移和侵襲的能力。miR-30d通過負向調節Galphai2的表達可以促進HCC細胞的侵襲和轉移能力。Anuradha Budhu等［4］通過對241例HCC患者的根治切除標本分析，通過qRT-PCR篩選出了20個差異表達的miRNAs，其中 miR-30c、miR-30a和 miR-30e的表達是下降的，并且miR-30c為表達水平較低的miRNAs之一。通過對轉移和生存率的分析，發現miR-30c、miR-30a和miR-30e與轉移成負相關，和生存率成正相關。

二、乳腺癌

Yu等［5］的研究表明miR-30家族可以與其靶基因Ubc9(ubiquitin-conjugating enzyme 9)和 ITGB3(integrinb3)作用，來影響乳腺腫瘤起始細胞(tumor-initiating cells，BT-Ics)的活性。miR-30在BT-ICs中表達減少，Ubc9和ITGB3的表達上調。miR-30可以通過減少Ubc9的表達來抑制BT-ICs的自我更新能力，而通過沉默ITGB3誘導BT-ICs的凋亡。Li等［6］通過微陣列比較基因組雜交技術(Array-based comparative genomic hybridization，array-CGH)和功能文庫篩選方法(Functional Library Screening)對109例卵巢癌和73例乳腺癌標本進行分析，發現miR-30d表達增加。體外實驗表明miR-30d可以促進乳腺癌細胞的生長;抑制miR-30d可以觀察到細胞周期明顯停滯在G0/G1期;同時觀察到典型的衰老形態細胞;miR-30同時可以減少caspase-3的表達，抑制癌細胞的凋亡;體內實驗表明抑制miR-30d可以抑制腫瘤的生長;結合生物信息學的方法證實caspase-3可能為miR-30d的靶基因。EMT(epithelial-metastasis transition)是腫瘤轉移中常見過程，E-cadherin在EMT的過程中發揮了重要的作用，在EMT過程中E-cadherin的表達下降，而N-cadherin的表達增加。Cheng等［7］的實驗表明miR-30a與其靶基因Vim作用，可以抑制乳腺癌細胞系Hs578T和MDA-MB-231的EMT過程，抑制侵襲和轉移能力，且miR-30a的低表達與乳腺癌的預后成負相關。Zhu等［8］的研究表明在乳腺癌細胞系MDA-MB-468和MCF-7中，miR-30a可以負向調節beclin-1的mRNA和蛋白的表達。通過與beclin-1作用，miR-30a可以減少beclin-1介導的細胞自噬，從而抑制腫瘤的發生發展。除此之外，miR-30b在治療方面也有一定的作用。Ichikawa等［9］研究發現，經過曲妥珠單抗的處理，表皮生長因子受體2(human epidermalgrowth factor receptor-2，HER2)陽性的乳腺癌細胞系SKBR3和BT474中，miR-30b的表達上調。并且miR-30b可以抑制乳腺癌細胞的生長，使細胞周期停止在G1期，并且他們找到了相關的靶基因細胞周期蛋白E2(cyclin E2，CCNE2)。Wu 等［10］發現，在乳腺癌手術切除標本中，Ubc9的表達增加;結合生物信息學的方法驗證了miR-30e可以抑制Ubc9的表達;在乳腺腫瘤標本中miR-30e的表達下降，而外源性的miR-30e可以抑制細胞的生長。

三、肺癌

Kumarswamy等［11］發現在非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)中E-cadherin和miR-30a表達呈正相關。具有侵襲性和轉移性的肺癌細胞系轉染miR-30a后，細胞形態發生改變，伴隨Snai1的表達下降和E-cadherin的表達升高。應用雞胚轉移檢測方法發現miR-30a抑制體內水平的肺轉移和肝轉移。并且miR-30a在大部分檢測的NSCLC標本中表達下降。結合生物信息學和螢光素酶載體等方法證實Snai1可能是miR-30a的靶基因。miR-30a在判斷預后方面也有一定的作用，Hu等［12］對30個生存時間較長的患者和30個生存時間較短的患者血清進行了檢測，發現了四種差異表達的miRNA，分別為miR-486、miR-30d、miR-1和miR-499。其中miR-30d高表達的患者生存時間較短。Garofalo等［13］對miRNAs在耐藥性方面的作用進行了研究。他們發現在NSCLC中，由EGFR和MET受體介導的酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors，TKIs)抵抗的過程中，miR-30b、miR-30c、miR-221和 miR-222的表達增加，誘導 NSCLC對TKIs的耐藥性增加，結合生物信息學和螢光素酶載體等方法證實BIM(BCL2-like 11)和APAF-1(apoptotic peptidase activating factor 1)可能是相關的靶基因。Wu等［10］發現，在肺癌組織中，Ubc9的表達增加，利用生物信息學和螢光素酶載體等方法驗證了miR-30e可以抑制Ubc9的表達，進一步檢測發現腫瘤標本中miR-30e的表達下降，而外源性的miR-30e可以抑制細胞的生長，從而發揮類似于抑癌因子的作用。

四、消化系統腫瘤

除了卵巢癌和乳腺癌之外，Li等［6］發現miR-30d在結腸癌細胞系HCT116中表達上調;miR-30d可以促進癌細胞的生長;抑制miR-30d可以觀察到細胞周期明顯停滯在G0/G1期;細胞產生典型的衰老形態;miR-30可以減少caspase-3的表達，抑制癌細胞的凋亡;體內實驗表明抑制miR-30d可以抑制腫瘤的生長。所以caspase-3可能是其靶基因。Mosakhani等［14］的研究發現，在含有野生型 KRAS和 BRAF基因的抗EGFR難治性轉移性結直腸癌患者中，miR-30b和miR-30c與結腸癌的預后呈負相關。在生存時間較短的患者標本中，miR-30b和miR-30c的表達增加，提示了miR-30b和miR-30c在判斷預后中的作用。長期幽門螺桿菌的感染可以導致胃癌的發生［26］。最近的一篇文章報道了miR-30b在促進幽門螺桿菌生長方面的作用。Tang等［19］發現miR-30b可以與其靶基因ATG12和BECN1作用，抑制細胞的自噬作用，使得細胞內的幽門螺桿菌可以逃避自噬對它的清除，使幽門螺桿菌的感染持續存在，最終可能導致胃癌的發生。Joglekar［20］等發現miR-30族可以通過抑制Vimentin和Snail1的轉錄從而抑制胰腺上皮細胞EMT過程。

五、黑色素瘤

Gaziel-Sovran等［15］報道了miR-30b和30 d在黑色素瘤中的作用。他們發現miR-30b和30 d與腫瘤的分期、轉移、復發時間和存活時間有關。通過抑制其靶基因N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)還原酶GALNT7的表達促進了黑色素瘤細胞的轉移能力、增加了IL-10的表達從而導致免疫細胞的失活，起到了免疫抑制的作用。miR-30還可以通過促進細胞的衰老來抑制腫瘤的發生。

六、宮頸癌、卵巢癌

Martinez等［16］發現在HeLa細胞系中，由視網膜母細胞瘤(retinoblastoma，Rb)誘導的細胞衰老可以促進miR-30族的表達。進一步分析發現miR-30可以與其可能的靶基因BMyb作用，抑制細胞的增殖，促進細胞的衰老以及抑制DNA的合成。Bridge等［17］發現了miR-30在血管增殖方面的作用。在卵巢細胞系LEC中miR-30b可以導致體外模型中血管數量和長度增加。DLL4(Delta-like 4)屬于Notch家族的一個細胞膜結合的配體，在血管發展和生成中起著重要的作用。miR-30b和miR-30c可以與DLL4作用，增加血管的生成。Kumar等［18］發現miR-30d可以抑制TP53基因，從而下調p53蛋白的表達。因此，miR-30d可以抑制細胞的凋亡，抑制細胞周期停止和細胞的衰老，從而促進腫瘤的發生。

七、其他腫瘤

Quintavalle等［21］研究發現了 miR-30b和 miR-30c在腦膠質瘤中的作用。在對抗腫瘤壞死因子相關凋亡誘導的配體(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)中，miR-30b和miR-30c的表達上調，經過驗證miR-30b和miR-30c作用其靶基因caspase-3發揮TRAIL抵抗的功能，并且這種作用在肺癌細胞中也有體現。Chang等［22］的實驗證實miR-30e和miR-30c受到Myc調節。Myc可以與它們的啟動子結合，抑制miR-30e和miR-30c的表達，從而促進腫瘤尤其是淋巴瘤的發生。Wszolek等［23］篩選了在侵襲性和非侵襲性膀胱尿道上皮癌(urothelial carcinoma of the bladder，UCB)中差異表達的 miRNAs。發現在非侵襲性的UCB中，miR-200c、miR-141和miR-30b顯著減少，應用這三個miRNAs來進行對 UCB的診斷，其敏感性可以達到100%，特異性達到96．2%。在鼻咽癌中，miR-30e聯合其他四個miRNAs同樣具有判斷預后的作用。并且miR-30e與鼻咽癌的無疾病生存(disease free survival，DFS)成正相關［24］。Braun等［25］研究了 miR-30 在甲狀腺癌中(anaplastic thyroid carcinoma，ATC)的作用。發現miR-30d和miR-30e在ATC中表達顯著減少。通過分析miR-30d和miR-30e可以導致ATC細胞形態的改變以及波形蛋白(vimentin)表達下降;抑制miR-30d和miR-30e可以促使ZEB表達增加，促進EMT的過程;miR-30d和miR-30e可以抑制ATC細胞的體外侵襲能力;并且miR-30d和miR-30e可以抑制腫瘤壞死因子β受體 1(tumor-necrosis factorβ，TGFBR1)和 SMAD2的表達。

綜上所述，miR-30通過對靶基因的調控，從而調節細胞的分化、增殖和凋亡，參與腫瘤細胞的侵襲、血管浸潤和轉移。隨著對microRNA功能和作用機制研究的不斷深入，人們發現microRNA與其所調控的靶基因之間存在復雜的調控網絡，一個microRNA分子可能調控多個基因的表達，一個基因也可能接受多個microRNA分子的調控。而microRNA自身的表達也受多種機制的調控，在細胞內，microRNA既可通過調控相關基因的表達調控細胞內的信號傳導，同時其自身的表達也受細胞內某些信號傳導通路的調控，可能形成一個封閉的細胞內信號調控環路。深入研究microRNA相關的細胞內信號傳導的調控網絡，將有助于進一步揭示腫瘤的發生和發展機制，為腫瘤的治療提供新的視角。由于microRNA可同時調控多個基因，其在細胞生物學中的意義顯得尤為突出，miR-30族是近年來新發現的一類microRNA，目前發現其可以靶向的腫瘤相關基因有:Galphai2、ITGB3、Smad2、TGFBR1、p53［27-28］、B-myb、DLL4、Snail 1、MYCN［29］。miR-30不僅調控腫瘤的生長和轉移，而且可能在腫瘤血管生成和腫瘤干細胞中也具有重要作用，因此隨著研究的不斷深入，miR-30可能會成為腫瘤臨床治療的一個潛在手段。

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