骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞動(dòng)員治療缺血性腦損傷的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展

劉 軻 馮靜靜 劉敬霞 李建生 (河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000)

缺血性腦血管病是病理過程涉及復(fù)雜的時(shí)間和空間級(jí)聯(lián)反應(yīng)，致殘率和致死率均較高。目前，臨床治療主要是通過超早期溶栓和腦神經(jīng)保護(hù)等措施來挽救缺血半暗帶的神經(jīng)元和促進(jìn)損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)，雖然部分患者神經(jīng)功能恢復(fù)較好，但仍有50% ～70%的存活者遺留癱瘓、失語(yǔ)等嚴(yán)重殘疾〔1，2〕。目前研究最多的是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)為缺血性腦病的治療提供了新途徑，現(xiàn)就BMSCs動(dòng)員治療缺血性腦病的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 BMSCs的生物學(xué)特點(diǎn)

1.1 定義 Minguell等〔3〕將BMSCs概括為:存在于骨髓基質(zhì)內(nèi)的非造血細(xì)胞來源的細(xì)胞亞群，它們可以在體外擴(kuò)增，在體外經(jīng)誘導(dǎo)后最終分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌腱細(xì)胞、肌管、神經(jīng)細(xì)胞與支持造血干細(xì)胞的基質(zhì)。同所有的干細(xì)胞一樣，骨髓也具有自我更新能力和多向分化潛能。它雖然僅占骨髓單核細(xì)胞的0.001% ～0.01%，且隨著年齡的增加而減少，但是卻具有驚人的增值能力。

1.2 BMSCs的體外分離、培養(yǎng)及分化 BMSCs是存在于骨髓中的一種非造血干細(xì)胞，可通過不同方法進(jìn)行體外分離及培養(yǎng)，具有高度的增殖能力，易純化，均一性好;體外培養(yǎng)時(shí)呈成纖維樣集落形成單位，并貼壁生長(zhǎng)。閆西剛等〔4〕發(fā)現(xiàn)BMSCs在體外分離、培養(yǎng)的條件下生長(zhǎng)良好，經(jīng)誘導(dǎo)后可大量分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。杜振宗等〔5〕收集成人骨髓血，利用建立體外分離培養(yǎng)、純化BMSCs的方法，觀察BMSCs的增殖及生長(zhǎng)特性。發(fā)現(xiàn)利用貼壁方法獲取的BMSCs具有較強(qiáng)的增殖的能力，純度高，可以作為組織工程的種子細(xì)胞，為組織工程血管的構(gòu)建提供依據(jù)。徐龍強(qiáng)等〔6〕實(shí)驗(yàn)研究也發(fā)現(xiàn)在體外特定環(huán)境下誘導(dǎo)原代BMSCs向神經(jīng)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化，并向神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化。可見BMSCs作為一種較為理想的種子細(xì)胞，為治療神經(jīng)元性疾病提供了一個(gè)極為豐富的供體細(xì)胞資源平臺(tái)。

2 BMSCs的可塑性研究

BMSCs具有的跨系譜、跨胚層分化的潛能稱為BMSCs的可塑性。也稱之為轉(zhuǎn)分化或橫向分化。過去認(rèn)為哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)屬不可再生組織，但近年來研究表明成體哺乳動(dòng)物齒狀回、嗅球和脊髓都存在神經(jīng)發(fā)生，在體內(nèi)外能化為包括神經(jīng)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞在內(nèi)的神經(jīng)細(xì)胞〔7〕。姚曉黎等〔8〕報(bào)道了多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究認(rèn)為BMSCs在一定的誘導(dǎo)條件下，可在體外體內(nèi)分化成為神經(jīng)干細(xì)胞、神經(jīng)元小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞等。而BMSCs的可塑性研究不僅是BMSCs能跨胚層分化為外胚層的神經(jīng)組織細(xì)胞，同時(shí)也有研究表明BMSCs移植后對(duì)腦缺血后梗死灶周圍神經(jīng)細(xì)胞可塑性及突觸在生的影響。為BMSCs動(dòng)員療法治療缺血性腦病提供了理論依據(jù)。張小喬等〔9〕利用 SD大鼠制作腦缺血模型，并將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、磷酸鹽緩沖液(PBS)組和BMSCs組，分別通過測(cè)定梗死灶周圍腦組織突觸素(SYN，是突觸重建和突觸可塑性的重要標(biāo)志)和腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF，一種重要的調(diào)節(jié)修飾已有的突觸結(jié)構(gòu)和誘導(dǎo)新的突觸聯(lián)系形成的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子)mRNA的表達(dá)來研究腦缺血24 h后移植BMSCs的大鼠神經(jīng)缺損評(píng)分(NSS)，發(fā)現(xiàn)與模型組及PBS組大鼠相比，BMSCs組的NSS評(píng)分較低，但SYN和BDNF mRNA的表達(dá)則明顯較高，結(jié)果證實(shí)經(jīng)靜脈移植BMSCs能促進(jìn)腦缺血大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)，并在突觸可塑性及突觸再生中發(fā)揮作用，而突觸的再生及神經(jīng)的可塑性是腦缺血后神經(jīng)功能長(zhǎng)期修復(fù)的重要組成部分。

3 BMSCs動(dòng)員和歸巢

3.1 動(dòng)員 骨髓釋放其干細(xì)胞到外周血的現(xiàn)象稱為BMSCs動(dòng)員。其動(dòng)員的途徑主要包括動(dòng)員劑的應(yīng)用、原位增殖及動(dòng)員后移植。廣義上講，BMSCs動(dòng)員指通過機(jī)體本身的代償機(jī)制以及外界人為因素干預(yù)，促使BMSCs遷移到骨髓外，以增加循環(huán)血液中干細(xì)胞數(shù)量。狹義上，則主要指通過使用動(dòng)員劑等藥物進(jìn)行干預(yù)促使BMSCs釋放到外周血。目前所使用的動(dòng)員劑主要有粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子(SDF-1)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、干細(xì)胞因子(SCF)、白細(xì)胞介素(IL)-3、IL-12、IL-27和化療藥物，如環(huán)磷酰胺(Cy)等，以G-CSF、GM-CSF的應(yīng)用最為廣泛，G-CSF、GM-CSF在動(dòng)員造血干細(xì)胞的同時(shí)，對(duì)EPC和骨髓基質(zhì)細(xì)胞也有動(dòng)員作用。G-CSF還可引起外周血中黏附分子升高，以影響干細(xì)胞對(duì)骨髓基質(zhì)和EPC的黏附作用〔10〕。這一過程同時(shí)涉及一系列細(xì)胞黏附分子和趨化因子、生長(zhǎng)因子等的相互調(diào)節(jié)反應(yīng)，影響干細(xì)胞的黏附、遷移和定居特性，使干細(xì)胞穿過基質(zhì)膜和血管內(nèi)皮層進(jìn)入循環(huán)血流中，致外周血中的干細(xì)胞數(shù)增加。

3.2 歸巢 BMSCs的歸巢特性是指它們能自動(dòng)向損傷及炎癥區(qū)域的定向遷移。進(jìn)而動(dòng)員的BMSCs才可能完成對(duì)缺血損傷部位的修復(fù)。BMSCs能夠表達(dá)多種細(xì)胞因子及趨化因子，而許多研究表明，缺血性腦病患者存在局部和全身的炎癥反應(yīng)，在患者的血液中炎癥分子包括細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1B、IL-8、IL-18)和可溶性黏附因子〔L-selectin、E-selectin、P-selectin、可溶性黏附因子(ICAM)、血管細(xì)胞間黏附因子(VCAM)〕升高〔11〕。這意味著BMSCs有向缺血損傷區(qū)組織局部趨化的能力。有研究認(rèn)為，移植含有血管內(nèi)皮細(xì)胞(EPC)的混合細(xì)胞成分(這些細(xì)胞多可以合成釋放多種促進(jìn)BMSCs遷移、分化和血管新生的因子，如 VEGF、SCF、G-CSF、SDF-1等)，更有利于促使中風(fēng)后缺血邊界區(qū)的血管生成，改善缺血組織的血液循環(huán)，緩解缺血狀態(tài)〔12〕。

4 BMSCs動(dòng)員治療缺血性腦損傷的可能機(jī)制

4.1 BMSCs自身分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)樣細(xì)胞BMSCs具有多潛能干細(xì)胞的特性，在特定條件下可以打破胚層起源的限制向外胚層神經(jīng)元細(xì)胞和內(nèi)胚層肝卵圓細(xì)胞分化，發(fā)展為成熟神經(jīng)細(xì)胞，替代損傷細(xì)胞，重建神經(jīng)環(huán)路，從而達(dá)到恢復(fù)神經(jīng)功能的目的〔13〕。郭聞師等〔14〕實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)大鼠的BMSCs體外多次傳代后，經(jīng)全反式維甲酸(ATRA)和神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)誘導(dǎo)后可分化為神經(jīng)細(xì)胞元樣細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。同時(shí)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示單味中藥如仙茅水提物誘導(dǎo)后的BMSCs有神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)和肢質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)表達(dá)，促進(jìn)BMSCs向神經(jīng)元細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的分化和轉(zhuǎn)化化。作用機(jī)制可能為:①增強(qiáng)細(xì)胞Na-K-ATP酶的活性，直接增加細(xì)胞代謝，促進(jìn)細(xì)胞分裂，②增加某些細(xì)胞受體開關(guān)的啟動(dòng)，而這些受體的啟動(dòng)促使其向神經(jīng)元細(xì)胞分化〔15〕。

4.2 刺激內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞和神經(jīng)祖細(xì)胞的增殖分化 在正常情況下，中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)存在尚未激活的神經(jīng)元。腦缺血后，BMSCs進(jìn)入體內(nèi)后，可能通過某種機(jī)制激活了這些神經(jīng)干細(xì)胞，從而再生為神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，促進(jìn)了神經(jīng)功能的恢復(fù);郭亮等〔16〕將BMSCs注入大腦中動(dòng)脈栓塞后的大鼠體內(nèi)并在移植前的48 h在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入10 μmol/L BrdU進(jìn)行標(biāo)記，28 d后在熒光顯微鏡下可見腦梗死灶(海馬)邊緣聚集大量BrdU陽(yáng)性細(xì)胞，而健側(cè)腦組織中BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量相對(duì)較少。腦梗死灶邊緣可見少量BrdU陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)元特異性烯醇化酶。說明BMSCs可促進(jìn)局灶性腦缺血大鼠內(nèi)源性神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖、遷移，從而對(duì)腦缺血再灌注損傷起保護(hù)作用。

4.3 應(yīng)用G-CSF動(dòng)員促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù) 目前已經(jīng)證實(shí)G-CSF是BMSCs強(qiáng)有力的動(dòng)員劑，當(dāng)腦缺血損傷時(shí)，G-CSF可動(dòng)員大量BMSCs向損傷部位遷移，在特定的病理環(huán)境下分化為神經(jīng)細(xì)胞，以修復(fù)損傷的神經(jīng)組織〔17〕。其作用機(jī)制研究進(jìn)展可能為以下幾個(gè)方面。

4.3.1 抑制腦缺血損傷神經(jīng)細(xì)胞凋亡 研究證明，大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞后再灌注的神經(jīng)細(xì)胞凋亡是伴隨著壞死發(fā)生的，而BMSCs能夠刺激內(nèi)源性神經(jīng)細(xì)胞再生，抑制細(xì)胞凋亡，從而減少缺血再灌注損傷細(xì)胞凋亡的發(fā)生，明顯改善腦缺血大鼠的神經(jīng)功能〔18〕。黃月等〔19〕研究證明，向腦缺血再灌注后大鼠注入BMSCs能上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，下調(diào)Bax蛋白表達(dá)，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡，改善腦損傷大鼠的神經(jīng)功能。劉雪平等〔20〕觀察應(yīng)用G-GSF動(dòng)員自體BMSCs對(duì)大鼠腦缺血后神經(jīng)凋亡的影響。他們將SD大鼠隨機(jī)入選的72只分為模型動(dòng)員組、模型非動(dòng)員組和假手術(shù)組;用線栓法制備大鼠局灶性大腦中動(dòng)脈栓塞/再灌注模型，并以CD34和Brdu免疫組化染色觀察比較大鼠腦缺血/再灌注后的新生血管生成情況，模型動(dòng)員組大鼠腦組織缺血再灌注后48，72 h缺血區(qū)邊緣可見新生毛細(xì)血管生成且逐漸增多，72 h至1 w后可見大量新的毛細(xì)血管，與模型非動(dòng)員組比較，48 h后細(xì)胞凋亡改善明顯;而模型未動(dòng)員組僅有少量新生毛細(xì)血管;48 h后缺血區(qū)新生毛細(xì)血管密度也較低。結(jié)果表明，BMSCs經(jīng)G-CSF動(dòng)員后可向大鼠腦缺血區(qū)趨化并可分化為神經(jīng)元前體細(xì)胞，顯著促進(jìn)腦缺血區(qū)血管再生，降低腦神經(jīng)功能評(píng)分，降低細(xì)胞凋亡率。李建生等〔21，22〕實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果也顯示，應(yīng)用G-GSF動(dòng)員BMSCs并聯(lián)合中藥腦脈通(由大黃、人參、川芎、葛根組成)可以抑制腦缺血損傷引起的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，影響相關(guān)凋亡蛋白 Fas、Fasl、caspase-3及 Bax、Bal-2的表達(dá)，其作用機(jī)制可能為在腦缺血早期下調(diào)了的促凋亡基因Fas、Fasl及Bax的表達(dá)，后期上調(diào)了抑凋亡基因Bal-2的表達(dá)，進(jìn)而阻抑caspase-3引起的凋亡瀑布反應(yīng)，從而發(fā)揮對(duì)腦缺血神經(jīng)細(xì)胞凋亡的阻抑作用。

4.3.2 促進(jìn)腦缺血損傷后血管新生 張子強(qiáng)等〔23〕研究表明應(yīng)用G-CSF動(dòng)員自體骨髓干細(xì)胞，能夠促進(jìn)大鼠腦組織缺血區(qū)的血管新生，改善缺血局部血流灌注并促進(jìn)其腦功能的恢復(fù)，其機(jī)制應(yīng)該是部分動(dòng)員的EPC“歸巢”到腦缺血區(qū)并分化形成新生血管。

4.3.3 促進(jìn)缺血性損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù) 腦缺血后造成大量神經(jīng)元細(xì)胞缺失導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的功能難以恢復(fù)。目前的藥物治療作用有限。近年來隨著干細(xì)胞研究的深入，發(fā)現(xiàn)BMSCs是一組具有多向分化潛能和自我更新能力的細(xì)胞群，在生長(zhǎng)和修復(fù)過程中起重要作用。葛朝莉等〔24〕實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)G-CSF作為BMSCs強(qiáng)有力的動(dòng)員劑，可以大大提高外周血的干細(xì)胞數(shù)量。說明G/CSF能夠改善腦缺血大鼠的神經(jīng)功能。而多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果也證實(shí)在缺血性腦梗死的急性期給予實(shí)驗(yàn)大鼠腹腔內(nèi)注射G-CSF，循環(huán)中被動(dòng)員的干細(xì)胞數(shù)量會(huì)明顯增加，因而在缺血腦組織局部炎癥反應(yīng)的“呼喚作用”下，歸巢的干細(xì)胞數(shù)量增多，而歸巢干細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量決定了大鼠梗死腦容積減小、缺血區(qū)新生血管再生，進(jìn)而改善腦缺血大鼠的神經(jīng)功能〔25，26〕。

5 問題與展望

盡管近年來有關(guān)人BMSCs的分離、培養(yǎng)和神經(jīng)分化潛能及腦缺血性疾病應(yīng)用方面的研究很多，并取得了較大的進(jìn)展，但仍存在一些問題有待解決。如BMSCs培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)化及干細(xì)胞身份的確定是相關(guān)研究的前提，并且現(xiàn)在仍有尚未被證實(shí)的骨髓干細(xì)胞表面標(biāo)志，因此在BMSCs的鑒定上存在困難。而關(guān)于BMSCs的具體治療機(jī)制仍未明了，BMSCs能否分化為具有完全功能的宿主神經(jīng)細(xì)胞并與宿主細(xì)胞建立正常聯(lián)系，重建缺血損傷的神經(jīng)功能;在促進(jìn)內(nèi)源性干細(xì)胞增殖等方面是否具有更為積極的修復(fù)作用尚不得而知;與BMSC s研究的整體水平相比，中醫(yī)藥對(duì)BMSCs作用的研究尚處于探索階段，相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道較少。總之，BMSCs動(dòng)員在治療缺血性腦損傷方面具有廣闊的發(fā)展前景。BMSCs向神經(jīng)細(xì)胞方向分化的潛力及移植后對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物缺血性腦損傷的功能改善作用為人類的神經(jīng)系統(tǒng)疾病尤其是腦缺血性疾病的治療提供了一條新的途徑。

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22 李建生，田玉收，王丁超，等.腦脈通聯(lián)合骨髓干細(xì)胞動(dòng)員對(duì)腦缺血大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡及Bax、Bcl-2表達(dá)的影響〔J〕.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2010;33(6):372-7.

23 張子強(qiáng)，高順宗，劉雪平.動(dòng)員自體骨髓干細(xì)胞促進(jìn)大鼠急性腦缺血損傷后血管新生的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2004;24(7):645-7.

24 葛朝莉，白潤(rùn)濤，韓漫夫.動(dòng)員自體骨髓干細(xì)胞對(duì)大鼠腦缺血/再灌注損傷后bFGF表達(dá)的影響〔J〕.疑難病雜志，2009;8(1):9-11.

25 趙 菁，高 波.粒細(xì)胞集落刺激因子動(dòng)員骨髓干細(xì)胞治療大鼠急性腦梗死〔J〕.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合急救雜志，2007;14(6):374-7.

26 趙 菁，高 波，張志明.粒細(xì)胞集落刺激因子動(dòng)員骨髓干細(xì)胞治療腦梗死時(shí)間窗的研究〔J〕.天津醫(yī)藥，2009;37(5):396-8.