支氣管哮喘臨床蛋白質組學研究進展

盧洪華，李艷春，華樹成

（吉林大學第一醫院，吉林 長春130021）

哮喘是一種常見慢性炎癥性疾病，其發病率有逐年上升的趨勢。由于病因復雜，表型多樣，多年來單純從基因方面研究并沒有取得哮喘診治方面的突破。基因是源頭，真正發揮功能的是蛋白質。一般來說，機體在出現病理變化之前，體內的蛋白質在成分和量方面都會發生相應改變，因此，以研究疾病相關蛋白的蛋白質組學應運而生。通過蛋白質組學技術揭示哮喘病理狀態下異常表達的蛋白質以及疾病不同時期的蛋白變化水平，可以篩選出與哮喘相關的蛋白標志物，特別是可能發現以往從未被與哮喘相關聯的新蛋白，從而有助于哮喘的診斷、病情評估、預后的預測，由此進一步開展針對性的生物治療。本文將主要就哮喘臨床蛋白質組學研究進展進行綜述。

1 蛋白質組學相關技術在哮喘研究中的應用

目前蛋白質組學依賴的基本技術是雙向凝膠電泳（2－DE）、質譜分析及生物信息技術。其中質譜技術又包括電噴霧電離飛行時間質譜（ESI－TOFMS），基質輔助激光解析／電離飛行時間質譜（MALDI－TOF－MS）以及表面增強激光解析／電離飛行時間質譜（SELDI－TOF）等［1］。從經典的雙向電泳－質譜技術到不依賴膠的SELDI－TOF蛋白質芯片技術，可根據所選標本類型進行選擇。長期以來，因某些標本類型所含蛋白量少（如支氣管活檢標本），難以應用蛋白質組學方法予以檢測。隨著蛋白質組學高通量和定量蛋白質組學技術的進展，以及相關儀器靈敏度的提高，上述問題已開始得到解決。如TMT和iTRAQ聯合納米LC MS／MS技術已經用于鼻灌洗液（NLF）［2］和支氣管活檢［3］的研究。

2 標本類型的選擇

標本類型的選擇對于哮喘研究的成功與否至關重要。可供蛋白質組學研究的哮喘標本類型包括支氣管肺泡灌洗液（BALF）、誘導痰、呼出氣冷凝液（EBC）、呼出氣（EB）、血漿、鼻灌洗液（NLF）、支氣管肺活檢等。上述標本類型應用于哮喘研究各具優點和不足。

BALF可以反映呼吸道內蛋白情況，可發現氣道重要的病理調節因子，但具有較大的侵入性。誘導痰也可反映氣道組織液情況，相對BALF來說侵入性小，但其需要嚴格的標準化操作規程，且誘導痰易受唾液污染，健康者亦多難以排出足量的痰液用于分析。作為較有價值的非侵入性檢查手段，EBC和EB可反映呼吸道實際情況，但因標本所含蛋白質量少，相關的蛋白質組學研究不多。血漿中蛋白量多，取材容易，可反映疾病不同表型的病理、生理及藥理過程，故該方面研究也較多，但缺點是組織局部的蛋白入血后會被稀釋，且血中高豐度蛋白的存在會干擾中低豐蛋白的篩選。NLF主要用于過敏性鼻炎或慢性鼻竇炎的研究，因哮喘同時累及上、下呼吸道，NLF用于哮喘相關方面的研究也有所增加。哮喘蛋白質組學最少使用的標本是支氣管、肺組織，因其標本通常由手術獲得，且具有很大的侵入性，標本中所含的蛋白量不多，故臨床蛋白質組學使用有限。但從科研角度講，支氣管或肺活檢標本直接來源于患病部位，對于篩選哮喘發病機制相關的生物標志物較為合適，其研究成果可供日后應用于臨床。

3 哮喘臨床蛋白質組學研究現狀

哮喘蛋白質組學研究最初始于動物模型，但動物模型仍然存在和人類哮喘不一致之處，因此近些年取樣于哮喘患者臨床標本的臨床蛋白質組學研究逐漸增加，多用于哮喘疾病診斷或發病機制相關蛋白標志物的篩選。Lindahl等最先應用蛋白質組學方法研究哮喘BALF，他們發現轉甲狀腺素，lipocalin－1，cystatin S和IgBF在哮喘患者中表達增加［4］。NLF主要用于過敏性鼻炎的研究，但也被用于少量哮喘患者的研究［4］。血漿的研究也逐漸增加，Lee等通過研究阿司匹林哮喘患者發現在阿司匹林刺激后其血漿中包括補體C3a、C4a在內的8種蛋白表達變化明顯，且提示補體與該病的發病機理有關［5］。Nicole等采用MALDI－TOF方法鑒別哮喘、慢性阻塞性肺疾病與健康者之間的血漿差異蛋白，發現α2巨球蛋白、結合珠蛋白、銅藍蛋白和血紅素結合片段等在各組間有差異表達［6］。哮喘患者血漿T淋巴細胞的蛋白質組學研究已經發現一些差異蛋白表達［7］。

誘導痰方面的蛋白質組學研究也多見于報道，Gray等利用SELDI－TOF方法比較哮喘、慢性阻塞性肺疾病、囊性肺纖維化和支氣管擴張者之間的痰液蛋白差異，從哮喘患者痰中分離出105種蛋白，其中一種clara細胞分泌蛋白在各組間有差異表達［8］。最近，Sina A 等采用鳥槍（shot gun）蛋白質組學技術及功能和網絡分析技術對哮喘組和健康組的誘導痰進行分析，結果共分離出254種蛋白，其中補體C3a在運動性哮喘者中選擇性上調［9］。作為疾病的靶器官或組織，如肺組織或支氣管，因未受到血漿蛋白的影響，故針對哮喘發病機制的研究前景廣闊，但因其取材具有明顯的侵入性，在全世界范圍內哮喘方面的研究還很少。目前哮喘臨床蛋白質組學研究已產生一些蛋白標志物，但所篩選出的蛋白仍處于研究階段，尚需臨床進一步評價來驗證其是否具有實用價值。另多為通過單純對比分析哮喘狀態與健康狀態之間的蛋白差異得到的結果，缺少針對哮喘不同分型的研究。

4 針對哮喘表型的臨床蛋白質組學研究是日后的研究方向

已有現越來越多的學者認為，哮喘不是一種單一的疾病，而是一組包括多種癥狀的綜合征。哮喘在臨床上多表現為典型的氣道高反應性和可逆性氣流受限的共同特征，但個體表現各異，如不同的氣道炎癥類型，不同的過敏激發物，對特異的環境暴露如運動或藥物等敏感，這種差異很可能是不同的病理生理過程所致的不同表型，從而可以解釋其不同的臨床經過和治療反應。目前，哮喘蛋白質組學研究已經產生大量候選疾病標志物，但很少被進一步確證，更少被應用于臨床，一個主要原因是缺少針對不同表型的研究。不同的表型可能有不同的分子發病機制。應用蛋白質組學方法研究哮喘表型的意義在于，通過比較不同表型之間的蛋白差異，可以發現針對不同表型的特異的蛋白標志物，進一步評估及預測病情進展風險，加深對發病機制的理解，進而針對性治療。

以往普遍認為，過敏性哮喘和非過敏性哮喘為哮喘的主要表型。近年來，哮喘各種表型逐漸被提出［10］，也產生了不同的哮喘表型分類和鑒別方法［11－14］。由于部分表型患者數量有限和臨床分型的難度，哮喘表型的臨床蛋白質組學方面研究相對較少，但已有逐漸增多的趨勢。已有學者研究間歇發作哮喘［15］和阿斯匹林哮喘［5］。預計未來應用蛋白質組學方法，針對哮喘的不同表型尋找疾病相關的生物標志物，將有助于針對哮喘不同表型進行個體化治療。

5 展望

目前，哮喘蛋白質組學研究已經取得一定進展，相關蛋白標志物逐漸被發現，但仍很少應用于臨床。因此，通過蛋白質組學方法，針對不同表型進行研究，以尋找哮喘相關蛋白標志物具有臨床應用前景。因哮喘表型各異，應仔細選擇研究對象并予以恰當分類，并結合具體研究目標選取合適的標本類型與相關的蛋白質組學技術。如上述條件具備，且操作規范，有望產生新的有價值的蛋白標志物。此外，應加強蛋白質組學與基因組學的關聯研究，找出與哮喘病理基因密切相關的蛋白分子，以開展全新的診斷和治療。

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