溫熱對胃癌MKN－45細胞凋亡及基因Bax表達的影響

蔣莉萍，邱 瑜，肖 鳳，吳鳳珍

（1.吉安市婦幼保健院 病理科，江西 吉安 343000；2.井岡山大學 病理教研室，江西 吉安 343000）

自從1975年在華盛頓召開的第一屆國際熱療會議以來，熱療作為一種新的腫瘤治療方法越來越引起人們的興趣與關注，唯獨熱療不開刀，無副作用，被譽為治療腫瘤的“綠色療法”。是繼臨床上常規抗癌療法之后的另一種新的抑癌方法［1，2］。目前研究認為，溫熱刺激能引起細胞凋亡［3，4］，而且溫熱療法和免疫、化療等療法聯合應用，還會提高免疫，化療等療法的效果［5，6］。本研究對胃癌 MKN－45細胞采用臨床有效且相對安全的43℃作為溫熱的條件，進行不同時間點的水浴熱處理，旨在通過觀察溫熱作用對MKN－45細胞凋亡及Bax基因表達的影響，為臨床溫熱療法提供一定的理論依據。

1 材料和器材

1.1 材料 人胃癌細胞株MKN－45胃癌細胞由江西省消化系疾病研究所饋贈；0.25%胰蛋白酶、高糖DMEM培養液（美國GIBCO公司）；DMSO（美國Amresco公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（南京凱基公司KGA7031－50）；DEPC（美國 Amresco公司）；Trizol Reagent（美國Invitrogen公司）；700 bp DNA ladder Marker（北京全式金生物技術有限公司）；Bax（上游5′－GGCCCACCAGCTCTGAGCAG－3′，下游5′－GCCACGTGGGCGTCCCAAAC－3′，575 bp）及β－actin（上游5′－TCAGGTCATCACTATCGGCAAT－3′，下游5′－AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA－3′，432 bp）PCR引物（美國Invitrogen公司）。

1.2 器材 超凈工作臺（新加坡ESCO公司）；二氧化碳培養箱（美國NUAIRE公司）；35 mm玻底培養皿（香港耐思科學有限責任公司）；RT－PCR電泳儀（美國Bio－rad公司）。

2 方法

2.1 細胞培養

用含10%胎牛血清的DMEM培養液常規培養（37℃、5%CO2飽和濕度）。

2.2 溫熱實驗

對照組37℃常規培養，不給予加熱處理，實驗組加熱溫度設置43℃，根據加熱時間不同分為0.5 h、1 h、2 h及3 h。將處于對數生長期內的MKN－45細胞常規消化、離心、重懸混勻，計數后，接種于35 mm NEST培養皿，置37℃、5%CO2恒溫孵育箱培養至貼壁。用封口膜封口后放入43℃的電熱恒溫水浴箱加熱（溫度波動＜±0.1℃）。確保整個培養皿底部平放淹沒于水中，將溫熱處理后的細胞換新鮮的10%FBS－高糖DMEM培養液，并放置37℃、5%CO2恒溫孵育箱培養24 h。倒置顯微鏡下觀察各溫熱時間組胃癌細胞MKN－45的形態改變。

2.3 原位末端標記（TUNEL）法檢測細胞凋亡

按本實驗2.2細胞樣品制備后，將自然晾干的細胞樣本（細胞爬片）浸入4%多聚甲醛固定液，室溫（25℃）固定30 min，樣本片浸入PBS漂洗2次，每次5 min；樣本片浸入通透液中，室溫促滲5 min，樣本片浸入PBS漂洗2次，每次5 min；樣本片浸入封閉液中，封閉10 min，樣本片浸入PBS漂洗2次，每次5 min；每張樣本片上滴加100μl上述配制好的DNaseⅠ反應液，25℃處理30 min，浸入1×PBS漂洗2次，每次5 min；每個樣本上滴加50μl Td T酶反應液，加蓋玻片放入溫盒中，37℃避光反應60 min，反應連接后的樣本片浸入PBS漂洗2次，每次5 min，注意避光；每個樣本上滴加50μl Streptavidin－HRP工作液，加蓋玻片放入溫盒中，37℃避光反應30 min，反應連接后的樣本片浸入PBS漂洗2次，每次5 min，DAB顯色。

凋亡細胞半定量分析：在普通光學顯微鏡下，每組培養皿隨機觀察5個視野，每個視野計數500個細胞，以計算平均凋亡細胞數所占百分比作為凋亡指數。

2.4 RT－PCR法檢測溫熱后胃癌細胞Bax的mRNA表達

MKN－45細胞接種于25 cm2培養瓶中，待細胞貼壁長至70%左右，分組溫熱處理后24 h，將溫熱處理后的各組細胞用預冷的PBS液洗3次，吸棄PBS液，依次加入Trizol、氯仿、異丙醇等，按常規抽提法提取細胞總RNA。瓊脂糖凝膠電泳結果顯示RNA的完整性，紫外分光光度法確定RNA的量和純度。以總RNA為模板按逆轉錄試劑盒上的說明進行逆轉錄反應。將擴增的DNA產物與1μl 6×上樣緩沖液（0.25%溴酚藍，50%甘油，10 m M EDTA）混合，加樣于含0.5%溴化乙錠的2%瓊脂凝膠，100 V電泳15 min，紫外線燈下觀察結果。然后用Quantity One4.6.2軟件分析灰度值，再計算灰度系數比。

3 結果

3.1 溫熱后胃癌細胞的形態結構改變

倒置顯微鏡觀察：與對照組相比，溫熱0.5 h部分貼壁MKN－45細胞出現皺縮，從胞膜伸出胞外的偽足逐漸減少，細胞逐漸變圓，細胞內顆粒成分逐漸增多，細胞漂浮，1 h相對較少，2 h細胞皺縮、變圓、漂浮明顯增多，細胞數目減少，3 h大部分細胞出現漂浮現象，提示溫熱0.5 h、1 h，2 h和3 h可明顯殺傷胃癌MKN－45細胞。

3.2 TUNEL檢測細胞凋亡情況

利用TUNEL熒光素原位末端標記技術，在熒光顯微鏡下觀察，凋亡細胞呈現黃綠色熒光，而非凋亡細胞不發黃綠色熒光，溫熱0 h、0.5 h、1 h、2 h和3 h后 MKN－45細胞凋亡率分別為11.3%、42.7%、33.4%、48.8%、44.3%，各溫熱時間組 MKN－45細胞凋亡率均明顯高于0 h時間組細胞的凋亡率（P＜0.01），并且溫熱1 h后的細胞凋亡率低于溫熱0.5 h，提示胃癌細胞自身對溫熱可產生一定的應激能力（表1，圖1）。

表1 不同溫熱時間組胃癌MKN－45細胞的凋亡率

圖1 不同溫熱時間組胃癌MKN－45細胞的TUNEL染色

3.3 RT－PCR法檢測Bax的mRNA表達

RT－PCR電泳結果顯示，與0 h對照組比較，0.5 h至3 h各溫熱時間組的細胞Bax的m RNA表達水平均明顯升高（P＜0.05）；3 h組達最高峰，1 h組低于0.5 h組；與TUNEL法測凋亡的趨勢相一致，提示溫熱可能誘導胃癌MKN－45細胞促凋亡基因過程中Bax基因激活，從而促進細胞凋亡（圖2）。

圖2 不同溫熱時間組胃癌MKN－45細胞Bax m RNA的RT－PCR檢測（β－actin為內參照）

3.4 統計分析

應用SPSS13.0統計軟件行統計分析，數據均采用均數土標準差表示（±SD），以單因素方差分析（one－way ANOVE）計算多組間差異，兩兩比較采用q檢驗，P＜0.05為有統計學差異，P＜0.01為有顯著性統計學差異。

4 討論

熱療是用人工加熱的方法治療惡性腫瘤，利用各種物理能量在人體組織中產生熱效應，使腫瘤細胞升溫到一定程度并維持一定時間，達到引起癌細胞凋亡和殺滅癌細胞及避免正常細胞遭受損傷的目的，另外熱療可增強免疫治療和化學藥物治療的效果，所以在目前的腫瘤綜合治療中倍受關注。當前研究表明，溫熱療法治療惡性腫瘤的作用機制主要是：1）改變細胞內環境，妨礙膜轉運蛋白及細胞表面受體的功能，直接導致癌細胞的死亡；2）抑制腫瘤血管生成及腫瘤轉移［7］；3）可促進免疫細胞包括自然殺傷細胞、T淋巴細胞和巨噬細胞的活性，促進細胞因子的合成及增強免疫效應，提高機體的免疫功能［8］；4）誘導腫瘤細胞凋亡［9］。有研究表明43℃～45℃溫熱作用可誘導腫瘤細胞凋亡［10］，但不同類型的腫瘤細胞對熱療的反應和敏感性也存在明顯差異［11］。本實驗首先采用倒置顯微鏡觀察到溫熱后MKN－45細胞體積變小變圓，核膜皺縮，核染色質均質化，呈細顆粒狀，隨著時間的延長，細胞內顆粒成分逐漸增多，細胞凋亡數增加。然后采用TUNEL法檢測溫熱誘導胃癌MKN－45細胞凋亡率情況，隨著溫熱時間的延長，細胞凋亡率也逐漸增加，另外溫熱1 h細胞活力比0.5 h時略高，提示 MKN－45細胞在熱刺激的持續作用下，很可能在1 h進入一個熱適應期。而3 h細胞組活力比2 h時略低，考慮隨著時間的延長，熱刺激3 h細胞組出現了大批細胞的死亡。

Bax是一種Bcl－2家族的前凋亡蛋白，而且是Bcl－2家族中最主要的凋亡基因。一般出現在胞漿中，并作為一種細胞損傷和刺激的傳感器。響應損傷和刺激，Bax將重新定位于線粒體表面并破壞在正常狀態下抗凋亡的Bcl－2蛋白的功能，可與線粒體上的電壓依賴性離子通道相互作用，介導細胞色素C的釋放，具有促凋亡作用［12］。在本研究中，溫熱作為一種應激，為此，我們推測Bax參與溫熱誘導胃癌細胞凋亡的過程。我們采用RT－PCR法檢測MKN－45細胞43℃溫熱下0.5 h、1 h、2 h和3 h后的Bax mRNA水平的表達情況。與對照組比較，MKN－45細胞各溫熱時間組Bax mRNA水平的表達明顯升高，溫熱3 h組達最高峰，1 h組低于0.5 h組（P＜0.01）。這與前面的凋亡實驗結果相吻合。提示溫熱可明顯抑制胃癌細胞增殖，誘導細胞凋亡，并可能是通過上調Bax水平的表達而促進胃癌細胞凋亡。

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