Graves病治療前后CD3-CD56+的變化及臨床意義

梁金明，陳聰，許琳，李青，歐志蓮，劉永鵬

(廣東醫(yī)學院附屬湛江中心醫(yī)院，廣東湛江524037)

Graves病治療前后CD3-CD56+的變化及臨床意義

梁金明，陳聰，許琳，李青，歐志蓮，劉永鵬

(廣東醫(yī)學院附屬湛江中心醫(yī)院，廣東湛江524037)

目的檢測CD3-CD56+在Graves病治療前后變化，探討NK細胞在治療過程中的變化及ADCC效應對Graves的影響或作用。方法選取正常對照組22例，Graves病初次發(fā)現(xiàn)且未治療病人33例，抗甲狀腺藥物(ATD)治療后緩解患者30例，完全緩解患者12例，及復發(fā)患者11例，用流式細胞術檢測CD3-CD56+的比值。結果正常對照組結果為7.03±3.91，初發(fā)組結果為4.83±2.72，緩解組結果為5.12±3.19，完全緩解組結果為7.91±4.05，復發(fā)組結果為6.97±3.28；初發(fā)組及緩解組結果低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.018，P=0.043)，初發(fā)組結果明顯高于完全緩解組，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.007)；緩解組結果低于完全緩解組，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.016)。結論Graves病CD3-CD56+低于正常，ADCC效應及NK細胞的其他免疫功能有可能受到損害或限制，破壞體內(nèi)的免疫平衡或免疫功能紊亂。CD3-CD56+結果對Graves各階段病程的診斷、治療及預后有臨床意義。

Graves病；白細胞抗原分化群CD3-CD56+;自然殺傷細胞;抗體依賴細胞介導的細胞毒作用;流式細胞術

Graves病(Graves’disease，GD)是一種常見內(nèi)分泌異常疾病，與自身免疫性有關，屬Ⅱ型超敏反應，引起這種自身免疫反應的因素還不清楚，其機制之一為NK細胞介導的ADCC效應，而NK細胞的表面標志主要是CD56+及CD16+，有研究表明NK細胞與甲狀腺細胞內(nèi)分泌的自身抗體有關[1]，Graves的病因和復發(fā)因素尚未完全清楚，國外對Graves病的治療主要以[3]I為主，國內(nèi)對Graves病治療以ATD較多，但復發(fā)率高，給患者造成極大的精神負擔和嚴重影響生活質(zhì)量，而粵西等沿海地區(qū)是Graves病的高發(fā)區(qū)，本研究通檢測正常人群、Graves病初發(fā)、緩解、完全緩解及復發(fā)患者CD3-CD56+占淋巴細胞比值變化，探討Graves病程不同階段的NK細胞變化及ADCC效應。

1 材料與方法

1.1 標本收集與處理在健康體檢者中隨機選擇22例作正常對照組(簡稱正常組)，根據(jù)《內(nèi)科學》第6版[2]Graves診斷標準分初次發(fā)現(xiàn)且未治療病人33例(簡稱初發(fā)組)，抗甲狀腺藥物(ATD)治療后緩解患者30例(TSH、TT3、TT4結果比治療前有好轉，簡稱緩解組)，完全緩解患者12例(TSH、TT3、TT4結果完全正常，簡稱完全緩解組)及復發(fā)患者11例(TSH、TT3、TT4正常后再出現(xiàn)符合Graves結果，簡稱復發(fā)組)，其中男性39例，女性69例，年齡11～80歲。抽血2ml用EDTA-K2抗凝全血，用流式細胞術檢測CD3-CD56+占淋巴細胞比值。

1.2 儀器及試劑

1.2.1 儀器美國貝克曼庫爾特公司FC500流式細胞儀。

1.2.2 試劑CD3-CD56+試劑使用美國貝克曼庫爾特公司生產(chǎn)TETRACHROME 45/56/19/3四色試劑盒。

1.3 方法按試劑盒說明及儀器要求操作：緩慢混勻全血后取100μl加入流式儀專用試管中；吸取45/56/19/3四色試劑10μl加入混勻放室溫避光孵育15min；加500μl Optilyse C溶血素后放室溫避光10min；加500μl BPS室溫避光10min；1500r/ min離心5min，棄上清液；加1ml PBS懸浮細胞上機檢測。

1.4 統(tǒng)計學分析用SPSS17.0軟件對各組CD3-CD56+淋巴細胞百分比進行正態(tài)分布及方差分析(student Newman Keuls test)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

正常對組CD3-CD56+結果為7.03±3.91，初發(fā)組結果為4.83±2.72，緩解組結果為5.12±3.19，完全緩解組結果為7.91±4.05，復發(fā)組結果為6.97± 3.28，初發(fā)組與緩解組低于正常對照組及完全緩解組，正常組、完全緩解組及復發(fā)組結果差異不顯著；正常對照組與初發(fā)組、緩解組差異有統(tǒng)計學意義(P＝0.018，P＝0.043)；初發(fā)組與正常對照組、完全緩解組差異有統(tǒng)計學意義(P＝0.018，P＝0.007)；緩解組與正常組、完全緩解組差異有統(tǒng)計學意義(P＝0.043，P＝0.016)；完全緩解組與初發(fā)組、緩解組差異有統(tǒng)計學意義(P＝0.007，P＝0.016)。

表1 各組別CD3-CD56+平均數(shù)、標準差及正態(tài)檢驗

表2 方差分析(student Newman Keuls test)P值表

3 討論

人自然殺傷細胞(natural killer cells,NK)是機體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，是機體天然免疫系統(tǒng)的主要細胞，產(chǎn)生細胞毒性或分泌細胞因子，在殺傷腫瘤細胞和病毒感染細胞及免疫調(diào)節(jié)中、免疫應答中發(fā)揮的重要作用，有學者報道NK樣細胞在免疫功能及腫瘤治療預后判斷的標志指標之一[3]。NK細胞亞群表型和生物學特征及NK細胞受體的識別的多樣性也有大量研究[4,5]。NK細胞識別正常組織細胞和變異細胞功能主要受其表面多種活化或抑制性受體調(diào)節(jié)的研究具有重要意義[6]，NK細胞的表型主要表達CD56+和CD16+而不表達CD3-，可將NK細胞分為CD56hi和CD56lo亞群，并在免疫應答的過程中發(fā)揮著不同的生物學功能。NK細胞殺傷腫瘤細胞和被病毒感染的靶細胞,機制主要是通過Fas(CD95)和FasL(CD95L)的相互作用、TNF和TNF受體的結合以及釋放顆粒酶和穿孔素破壞靶細胞。在NK細胞與靶細胞共孵育時,可檢測到TNF2α的釋放,一般認為TNF2α是由CD56hi細胞所分泌[7]。Mysliwiec等[8]研究結果顯示GD病變傾向于Th2型反應或Th1/Th2比例不平衡有關[9]。Giordano等[10]認為,IL21β介導的Fas表達在喬本甲狀腺炎細胞的凋亡中起重要作用,同時Fas介導的細胞凋亡可能是喬本甲狀腺炎組織破壞的主要病理機制。同時,細胞因子可以調(diào)節(jié)甲狀腺細胞的增殖，IFN2γ、TNF2α和IL21α可以影響TSH介導的細胞增殖效應。細胞因子不僅可以直接影響機體免疫細胞的活性,而且還可以通過影響甲狀腺細胞免疫相關分子的表達調(diào)節(jié)AITD的病程。

ADCC的殺傷機制是通過Fas與FasL起作用的，用活化的NK細胞表面可表達FasL,當NK細胞表達的FasL與靶細胞表面的相應受體Fas(CD 94)結合后形成Fas三聚體,使其胞漿內(nèi)的結構域相聚成簇并與Fas相關死亡結構域蛋白(FADD)結合,激活caspase-8,通過級聯(lián)反應最終導致靶細胞死亡。還可以通過TNF-α與TNFR-I作用途徑最終使細胞死亡。NK細胞受體有幾十種，通過與配體以特定的模式結合，活化或抑制效應調(diào)節(jié)NK細胞功能。抑制性受體特異性識別MHCⅠ類分子,抑制NK細胞的殺傷活性和其他效應功能,而活化性受體可被缺乏MHCⅠ類分子的靶細胞激活,當這些活化性受體被相應抗體封閉時,NK細胞殺傷功能降低。

表1及表2結果顯示初發(fā)組及緩解組CD3-CD56+百分比值均低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義，完全緩解組與正常對照組CD3-CD56+百分比值結果差異沒統(tǒng)計學意義，初發(fā)組與完全緩解組CD3-CD56+百分比值差別也有統(tǒng)計學意義。說明有Graves病發(fā)生時CD3-CD56+百分比降低，NK細胞低于正常，ADCC效應及NK細胞的其他免疫功能都有可能受到損害或限制，破壞體內(nèi)的免疫平衡或免疫功能紊亂。當Graves病得到完全緩解時，CD3-CD56+百分比值回復正常，說明ADCC的作用及NK細胞的功能也回復到正常水平。

從表中結果可以看出，緩解及完全緩解時CD3-CD56+百分比值是有差別且有統(tǒng)計學意義的。緩解時CD3-CD56+百分比值還是低于正常，ADCC效應或NK細胞免疫功能還有部分受損或未完全正常，只有完全緩解時，NK細胞免疫功能才完全正常。CD3-CD56+結果對Graves各階段病程的診斷、治療及預后有臨床意義。

復發(fā)組CD3-CD56+百分比值低于正常對照組及完全緩解組，又高于初發(fā)組及緩解組，也符合上述NK細胞免疫功能在Graves各病程中的臨床意義，能差別沒統(tǒng)計學意義，很有可能通過治療后，免疫功能產(chǎn)生耐受或紊亂所致。

有研究提示NK細胞具有免疫記憶功能，通過胚系基因編碼的抑制性受體和活化性受體來識別MHC I類分子及類樣分子，經(jīng)過初次活化后具有記憶性免疫細胞的特征[11]。這也許就是Graves在緩解、完全緩解及復發(fā)中CD3-CD56+結果有統(tǒng)計學意義的原因，從而可以通過CD3-CD56+結果來指導臨床治療的輔助依據(jù)。同時，在治療中增強免疫力[12]或調(diào)節(jié)免疫是否可以令Graves能更快更有效治愈及預防復發(fā)有臨床意義。

而對于Graves病的免疫機制、NK細胞的作用及ADCC效應的影響有待進一步的研究，如NK細胞表型、生物學活性、分泌因子等，ADCC活性測定等，這些對Graves病中的免疫作用或治療、預防復發(fā)可能都有臨床意義。

僅這些理論是不夠的，隨著NK細胞免疫功能研究的不斷發(fā)展[13]、ADCC效應及NK細胞活性測定這些研究有待進一步深入，對Graves病的發(fā)病機制、免疫功能的的關系及Graves病的治療和預防復發(fā)提供科學的依據(jù)。

[1]Artur B,Mlroslawa U,Anna SB.Analysis of Circulating Tγ/δLymphocytes and CD16 56cell populations in Children and Adolescents with Graves’Disease[J].Pediatr Res 2003,54:425.

[2]葉任高,陸再英,謝毅,等.內(nèi)科學[M].第6版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2004:725-741.

[3]黃祺琦,黃先豹,陳國安,等.CD3+CD56+NKT樣細胞在急性白血病患者體內(nèi)表達的研究[J].實驗與檢驗醫(yī)學,2010，(28)2：120-122、126.

[4]李子濤，楊濱燕，吳長有，等．人外周血NKT細胞亞群表型及生物學特征[J]．中國免疫學雜志，2011，2(27)：110-114．

[5]田志剛,魏海明.NK細胞受體識別的多樣性[J].中國免疫學雜志, 2004,1(20)：33-35．

[6]Hoglund P，Bredin P．Current perspectives of natural killer cell education by MHC class I molecules[J].Nat Rev Immunol．2010,10 (10)：724-734．

[7]Jacobs R,Hintzen G,KemperA et al.CD56brightcells differ in their KIR repertoire and cytotoxic features from CD56dim NK cells[J]. Eur J Immunol,2001;31:3121-3127.

[8]Mysliwiec J,Kretowski A,Topolska J,et al.Serum Th1 and Th2 profilecytokinelevelchangesinpatientwithGraves’ophthalmopathy treated with corticosteroids[J].Horm Metab Res, 2001,33(12):739-743.

[9]Kocjan T,Wraber B,Repnik U,et al.Changes in Th1/Th2 cytokine balance in Graves,desease[J].Pflügers Arch Eur J Physiol,2000, 440[Suppl]:94-95.

[10]Giordano C,Stassi G,Maria RD,et al.Potential involvement of Fas and its ligand in the pathogensis of Hashimoto′s thyroiditis[J] .Science,1997,275(5302):960-963.

[11]Sun JC，Beilke JN.Lanier LL．Adaptive immune features of natural killer cells[J]．Nature,2009,457(7229):557-561．

[12]楊凌輝,藍新英.聯(lián)合應用氨甲蝶呤治療Graves病臨床觀察[J].海軍醫(yī)學雜志,2003,24(3):228-229．

[13]Krueger PD，Lassen MG，Qiao H，et al．Regulation of NK cell repertoire and function in the liver[J]．Crit Bey Inununol,2011,3l (1)：43-52．

The changes and clinical significance of CD3-CD56+in Graves disease before and after treatment

LIAN Jinming，CHEN Cong，XU Lin，et al.Zhanjiang Central Hospital Affiliated to Guangdong Medical College,Guangdong Zhanjiang 524037,China

Objective To detect the changes of CD3-CD56+in Graves disease before and after treatment,study the changes of NK cells during treatment and explore the influence or effect of ADCC on Graves disease．Methods Taking 22 cases of health people as control group，33 cases of untreated GD patients，30 cases of after ATD treatment and remission patients，12 cases of complete remission patients and 11 cases of relapse patients as experimental group,we detected the ratio of CD3-CD56+in all subjects by flow cytometry.Results The results of CD3-CD56+in the health control group，untreated GD patients group，after ATD treatment and remission patients group，complete remission patients group and relapse patients group were 7.03±3.91,4.83±2.72, 5.12±3.19,7.91±4.05,6.97±3.28 respectively.The results of CD3-CD56+in the untreated GD patients group and after ATD treatment and remission patients group were lower than those of the health control group.Differences had statistical significance(P= 0.018，P=0.043).The result of CD3-CD56+in the untreated GD patients group was apparently higher than that of the complete remission patients group.Differences had statistical significance(P=0.007).The result of CD3-CD56+in the remission patientss group was lower than that of the complete remission patients group.Differences had statistical significance(P=0.016)．Conclusions The CD3-CD56+of GD is lower than that of normal people，ADCC and the immunolongic function of NK cells are likely to be injured or limited,the body's immune balance is disturbed and the immune function is disorder.The results of CD3-CD56+have the clinical significance in the diagnosis,treatment and prognosis of different stages of Graves Disease.

Graves'Disease；CD3-CD56+；Natural Killer Cells；ADCC；Flow Cytometry

R392．6,R593.2,R581.1

A

1674-1129(2013)03-0220-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2013.03.007

湛江市科技攻關項目編號：2010C3105008

梁金明，男，39歲，本科，副主任技師，主要從事免疫醫(yī)學檢測。