四川宜賓芽菜中乳酸菌分離篩選及菌相分析

尹 曦，蒲 彪,*，陳安均，敖曉琳，張小平

(1.四川農業大學食品學院，四川 雅安 625014；2.四川農業大學資源環境學院，四川 成都 611130)

四川宜賓芽菜中乳酸菌分離篩選及菌相分析

尹 曦1，蒲 彪1,*，陳安均1，敖曉琳1，張小平2

(1.四川農業大學食品學院，四川 雅安 625014；2.四川農業大學資源環境學院，四川 成都 611130)

采用6種選擇性培養基對宜賓芽菜中的乳酸菌進行分離純化，通過pH值測定和乳酸定性，篩選出72h時pH值在4.0以下和產生乳酸與標樣Rf值相近的菌株進行后續實驗。采用16S rDNA PCR-RFLP、ERIC-PCR對篩選出的菌株進行遺傳多樣性分析，通過分析16S rDNA序列研究宜賓芽菜中乳酸菌菌相及其系統發育。16S rDNA PCR-RFLP和ERIC-PCR指紋圖譜分析結果表明宜賓芽菜中乳酸菌遺傳多樣性豐富。根據16S rDNA PCR-RFLP和ERIC-PCR聚類圖分析，選取中心菌株進行序列分析，并構建系統發育樹，結果顯示：宜賓芽菜中主要的乳酸菌為戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、堅強腸球菌(Eenterococcus durans)。

宜賓芽菜；乳酸菌；菌相；16S rDNA PCR-RFLP ；ERIC-PCR

芽菜系將葉用芥菜的嫩莖、葉柄、中肋劃成絲，晾干腌制而成的一類蔬菜腌制品，主要分為咸芽菜和甜芽菜[1]。甜芽菜產于四川宜賓市，以白芽菜為原料，經加糖、腌漬等工藝加工而成[2]。宜賓芽菜作為四川“四大腌制菜”之一，因其成品色澤暗褐有光澤、質地嫩脆、氣味香甜、咸淡適口、營養豐富、暢銷全國。

芽菜以乳酸發酵為主，兼有少量的酒精發酵和甚微的醋酸發酵。乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)是一類能在可利用的碳水化合物中發酵產生大量乳酸的細菌的統稱[3]，也是芽菜乳酸發酵過程中的重要微生物，乳酸菌的菌相組成對芽菜產品品質、安全起著至關重要的作用。性能優良的乳酸菌應用于生產中，不但可以縮短發酵時間，改善產品風味，而且還能有效控制有害微生物的生長繁殖，同時還能降解亞硝酸鹽，減少致癌物質的形成，從而得到優質安全的產品[4]。另外，乳酸菌進入人體消化道后，具有促進腸胃蠕動，幫助消化，治療便秘，還有降血脂、增強機體免疫力的作用[5-6]。所以，對宜賓芽菜中乳酸菌菌相研究很有意義。

目前國內學者做了大量泡菜中乳酸菌的分離鑒定工作，但對宜賓芽菜的研究仍圍繞著生產工藝和品質改良[7-9]，對發酵過程中發揮重要作用的乳酸菌的分離鑒定以及菌相組成研究結果尚無報道。為此，本研究以宜賓芽菜中的乳酸菌為研究對象，對其乳酸菌菌相進行分析，為進一步發掘和利用性狀優良的乳酸菌種質資源提供依據，也為乳酸菌在芽菜中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

芽菜樣品采集自四川宜賓碎米芽菜有限公司，采集情況見表1。

表1 樣品來源Table 1Source of the samples

1.2 儀器與設備

Olympus CX21型光學顯微鏡 奧林巴斯(中國)投資有限公司；PHS-3C精密酸度計 成都世紀方舟科技；SW-CJ-IFD超凈工作臺 江蘇蘇凈集團有限公司；PYXDHS隔水式電熱恒溫培養箱 上海金鵬分析儀器有限公司；Eppendorf 5804R 冰凍離心機 武漢愛斯佩科學儀器有限公司；KL-UP-I-20超純水儀 愛斯泰克公司；梯度PCR儀、Bio-Rad電泳儀、Sequi-Gen GT電泳槽、UVP凝膠電泳圖像分析儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的分離純化

采用6種選擇性培養基對樣品中的乳酸菌進行分離，分別為：MRS培養基(主要分離乳桿菌)、Ellike培養基(主要分離乳球菌)、蔗糖硫胺培養基ZT(主要分離明串珠球菌)、月示胨甘油磷酸鈉培養基KF(主要分離腸球菌)、酪朊水解酵母膏胱氨酸蔗糖培養基和鏈球菌基礎培養基(主要分離鏈球菌)[3]。

粉碎樣品后用無菌生理鹽水梯度稀釋，采用涂布法，將雙層平板于37℃培養箱中培養，根據乳酸菌在選擇培養基上的生長特征、菌落形態，挑取單菌落革蘭氏染色、鏡檢，挑選革蘭氏染色為陽性單菌落，反復在培養基上劃線純化，純菌株于4℃保存。

1.3.2 菌株的篩選

1.3.2.1 pH值的測定

將分離純化得到的菌株以2‰的接種量接種于MRS液體培養基中(初始pH值為6.4)，放入37℃培養箱中培養12h，用PHS-3C精密酸度計，每隔24h取樣測定培養液pH值，連續測定72h。

1.3.2.2 乳酸定性實驗

采用紙層析法，在正丁醇-甲酸-水(80:15:5，V/V)的展開劑中展開，待層析液揮發之后，向層析濾紙噴灑3%溴甲酚藍酒精溶液顯色，并計算比移值Rf值。

在一定的條件下某種物質的Rf值是常數。Rf值的大小與物質的結構、性質、溶劑系統、層析濾紙的質量和層析溫度等因素有關，是一個定性分析的重要參數。

1.3.3 菌相分析

1.3.3.1 菌體DNA的提取

將篩選出的供試菌株接種于液體MRS培養基中，37℃培養至對數生長后期，用細菌基因組DNA提取試劑盒(北京天根生物科技有限公司)提取DNA。

1.3.3.2 16S rDNA PCR-RFLP分析

1)引物：本研究選用了P1和P6擴增供試菌株16S rDNA片段[10]。P1：5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AGA ACG AAC GCT -3’，P6：5’-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT TCA CCC C-3’。

2)反應體系為：PCR Mix 25μL，DNA模板2μL，P1和P6引物各0.5μL，超純水補足30μL，礦物油約10μL覆蓋。

3)PCR擴增程序：92℃預變性3min；94℃變性1min，57℃復性1min，72℃延伸2min，30次循環；72℃最后延伸8 min，4℃保存。

4)16S rDNA PCR-RFLP分析：對PCR擴增產物進行檢測，大小為1.5kb左右。擴增產物分別用限制性內切酶MspⅠ、HaeⅢ、HinfⅠ和HhaⅠ在37℃酶切過夜，TaqⅠ酶為65℃過夜。酶切產物以100bp DNA Marker作分子質量標準，在2.5%瓊脂糖凝膠上(含EB)，80V電泳3.5h后，用凝膠成像系統拍照，圖像保存為JPG形式。

1.3.3.3 ERIC-PCR指紋圖譜分析

ERIC-PCR的引物序列[11]，ERICⅠ：5’-ATGT A A G C T C C T G G G G A T T C A C-3’，E R I CⅡ：5’-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3’。

反應體系為：2×PCR Mix 5μL，ERICⅠ0.15μL，ERIC Ⅱ 0.15μL，模板DNA(50ng/mL) 1.0μL，超純水補足至10μL。

擴增程序為：94℃預變性2min；94℃變性1min，52℃復性1min，65℃延伸8min，30次循環；65℃最后延伸18min，4℃保存。

擴增產物經2.5%的瓊脂糖凝膠電泳(80V，3.5h)檢測，用EB染色，使用UV凝膠成象系統記錄成像，圖像保存為JPG形式。

1.3.3.4 代表菌株16S rDNA序列測定

根據16S rDNA PCR-RFLP和ERIC-PCR聚類分析結果以及菌株的菌落特征，選擇代表菌株進行序列測定。將待測菌株進行16S rDNA擴增，以P1、P6為測序引物，送上海英俊生物技術有限公司測序。

1.3.3.5 16S rDNA序列系統發育分析

代表性菌株的16S rDNA序列通過BLAST獲取與所測序列相似度最高的序列，ClustalX進行多重序列比對，利用聚類分析軟件Mega4.1，采用鄰位相連法(Neighbor-Joining)構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌分離純化

表2 不同培養基分離出的菌株數Table2 Number of strains isolated from different media

由表2可知，由于各樣品腌制情況不同，使得不同樣品所分離得到的菌株數差異較大。樣品A分離得到23株：MRS培養基分得9株，Ellike培養基分得2株，月示胨甘油磷酸鈉培養基分得12株。樣品B分得9株：月示胨甘油磷酸鈉培養基分得8株，蔗糖硫胺培養基分得1株。樣品C分得8株：MRS培養基分得3株，Ellike培養基分得3株，蔗糖硫胺培養基分得2株。從3個樣品中共分離得到40株菌進行后續實驗。

選擇6種乳酸菌選擇培養基是為了盡可能的將宜賓芽菜中的不同種屬的乳 酸菌分離出來，分離結果表明MRS培養基、Ellike培養基、月示胨甘油磷酸鈉培養基、蔗糖硫胺培養基得到了良好的分離效果。但是主要用于分離乳酸鏈球菌屬的酪朊水解酵母膏胱氨酸蔗糖培養基和鏈球菌基礎培養基對3個樣品均未分離得到株菌，可能原因有以下幾點：1)樣品中無鏈球菌；2)鏈球菌濃度很低，不容易分離出來；3)培養基不適合所采樣品中相應菌種的分離。

2.2 乳酸菌篩選

2.2.1 供試菌株發酵產酸能力

用PHS-3C精密酸度計測定了40株菌發酵液前72h的pH值變化情況，40株供試菌株發酵液在初始pH值的基礎上都有下降，只是下降程度不同，60%的菌株在48h時pH值達到最低，此后pH值變化不大，這與陳建華等[12]的研究結果較一致，因此選擇72h時pH值在4.00以下的29株菌株進行后續實驗，編號為：1、2、3、4、9、10、11、12、19、20、22、23、26、27、28、30、32、33、34、35、36、37、48、49、50、54、58、62、63。

2.2.2 乳酸定性分析[3]

對篩選所得到的29株菌進行紙層析檢測發酵產物中是否產生乳酸，發酵液與標準乳酸紙層析具有相近的Rf值時，表明菌株發酵產物中含有乳酸。

結果表明，大多數菌株發酵液的Rf值和乳酸標樣的Rf=0.739鄰近，其中9、11、22、23這4株Rf值偏離較遠，篩選掉這4株菌，剩下的25株菌株用于后續實驗。

2.3 供試菌株DNA檢測

用1.0%的瓊脂糖凝膠對供試菌株的基因組DNA作電泳檢測，溴化乙錠染色后，通過凝膠成像分析系統照相并觀察，基因組DNA瓊脂糖凝電泳見圖1。

圖1 部分菌株DNA電泳圖Fig.1 Electrophoresis pattern of DNA from part of bacteria

由圖1可知，在2000bp上方出現熒光條帶，而且無拖尾、條帶清晰，說明基因組DNA純度較好，能滿足后續實驗的需要。

2.4 供試菌株16S rDNA PCR-RFLP酶切圖譜分析

2.4.1 酶切圖譜分析

Ⅰ(c、d)酶切結果電泳圖Fig.2 Electrophoresis pattern of 16S rDNA PCR-RFLP digested by MspⅠ(a, b) and TaqⅠ(c, d)圖2 16S rDNA片段Msp Ⅰ(a、b)和Taq

對25株菌的16S rDNA進行擴增后，均產生約1.5kb的擴增條帶，采用不同的限制性內切酶(MspⅠ、HaeⅢ、TaqⅠ、HinfⅠ和HhaⅠ)酶切，其酶切產物經2.5%的瓊脂糖凝膠電泳分離，得到供試菌株的16S rDNA片段限制性內切酶酶切圖譜[13]，圖2是MspⅠ(a和b)和TaqⅠ的酶切圖(c和d)。

表3 16S rDNA限制性酶切圖譜類型Table3 Electrophoresis pattern types of 16S rDNA PCR-RFLP

由表3可知，這25株菌的16S rDNA擴增產物經5種限制性內切酶酶切后，產生酶切類型12種，每一種類型為一種16S rDNA遺傳類型。其中5株菌株屬于G型，4株屬于F型，3株屬于H型，3株屬于J型。其中B、D、F這3種類型之間、J和L之間都僅有一種酶HinfⅠ的酶切圖譜帶型有差異，另外G、H、I這3種類型間也僅有HaeⅢ的酶切圖譜帶型有差異，其余4種酶的酶譜帶型完全一致，表明這些菌株16S rDNA的堿基序列差異較小，但用適宜的限制性內切酶能將它們分離開來。

從不同的內切酶切割效果來看，HaeⅢ產生了7種酶切類型，MspⅠ產生了6種，HinfⅠ生了5種，TaqⅠ和HhaⅠ分別產生了3種，所有供試菌株共形成12種遺傳類型(表3)，帶譜較為豐富。

樣品A、B、C的菌株分別產生了7種、5種、2種16S rDNA遺傳圖譜類型，A樣品產生的圖譜類型最為多，即A樣品中的乳酸菌菌相較其他樣品豐富，這與實驗結果吻合。

2.4.2 聚類分析

將電泳圖譜條帶均一化處理后轉化成計算機可以識別的數值“1”和“0”，通過NTSYS2.1計算各菌株間的相似性，采用平均連鎖聚類法(UPGMA)將結果轉化為樹狀圖，得到16S rDNA PCR-RFLP分析樹狀圖。

由圖3可知，所有供試菌株在59%相似水平上聚為一類，分為2個分支，12號菌株單獨聚為一個分支，其余的聚成一個分支，說明12號菌株與其他菌株之間的同源性較低。在83%相似水平處被分為4個遺傳群。除菌株10和12單獨成群外，其余菌株構成了2個遺傳群。以群Ⅰ最大，由14個菌株組成；群Ⅲ次之，由9個菌株組成。來自相同樣品的菌株大都聚在一起：A樣品菌株構成了Ⅰ和Ⅱ兩個群，B、C樣品菌株構成了群Ⅱ和群Ⅳ，說明腌制時間和加糖與否對芽菜中乳酸菌的菌相有一定影響。

圖3 16S rDNA PCR-RFLP分析樹狀圖Fig.3 Dendrogram obtained from 16S rDNA PCR-RFLP

2.5 供試菌株ERIC-PCR圖譜分析

圖4 ERIC-PCR電泳圖Fig.4 Electrophoresis pattern of ERIC-PCR products

由圖4可知，利用ERIC引物對25株供試乳酸菌基因組DNA擴增，擴增產物電泳后檢測到多條譜帶，條帶分布在200～2000bp的范圍內。

根據指紋圖譜，采用平均連鎖法聚類，獲得ERICPCR指紋圖譜的分析樹狀圖，見圖5，所有菌在58%的相似性水平處聚為一類，在73%的相似水平下分為4個分支，群Ⅱ和群Ⅲ最大，都由9個菌株；其次是群Ⅰ，有4株菌；群Ⅳ僅有3株菌組成。來自相同樣品的菌株大都聚在一起，A樣品菌株構成了Ⅰ和Ⅲ兩個群，B、C樣品菌株構成了群Ⅱ和群Ⅳ，這一結果與16S rDNA PCR-RFLP的聚類結果基本相同，說明不同發酵時期的芽菜中乳酸菌菌相有差異。

圖5 ERIC-PCR分析樹狀圖Fig.5 Dendrogram obtained from ERIC-PCR

2.6 供試菌株16S rDNA-PCR序列系統發育樹分析

圖6 16S rDNA序列系統發育樹Fig.6 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences

根據16S rDNA PCR-RFLP、ERIC-PCR聚類分析與菌落特征，選取了10株菌(1、3、4、10、20、26、35、37、50、58)作為代表菌株進行16S rDNA序列測定，將所測的序列采用BLAST在NCBI搜索后，從GenBank中選取了包括片球菌屬、乳桿菌屬、腸球菌屬中的11株菌作為參比菌株，利用ClustalX(version 1.81)與供試菌株序列比對分析，然后通過Mega4.1軟件利用Neighbour-Joining法生成系統發育樹，結果見圖6。所選的10株中心乳酸菌分成3組，分別屬于片球菌屬(Pediococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、腸球菌屬(Enterococcus)。測序結果中片球菌屬5株，乳桿菌屬2株，腸球菌屬3株，即片球菌屬占50%，腸球菌屬占30%，最少是乳桿菌屬，僅占20%。其中，由戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)構成片球菌屬(Pediococcus)分支，由植物乳桿菌(L.plantarum)構成乳桿菌屬(Lactobacillus)分支，堅強腸球菌(E.durans)構成腸球菌(Enterococcus)分支。

3 討 論

3.1 細菌的16S rDNA基因大小適中，既含有高度保守序列，也具有相當的變異區，其RFLP是一種簡單、快速的在種、屬水平上鑒定大量菌株遺傳關系的方法。16S rDNA PCR-RFLP分析是目前廣泛采用的一種研究遺傳多樣性和系統發育關系的方法，此法能預測16S rDNA序列分析的結果，與16S rDNA序列分析的結果有較好的一致性[14]。本實驗所用的5種限制性內切酶中，HaeⅢ產生了7種帶型類型、MspⅠ產生了6種酶切帶型，都提供了豐富的遺傳信息，能較好地反映菌株之間的遺傳差異性，進而較好地分析其菌相組成。

rep-PCR指紋分析技術指利用細菌基因組上存在的短重復序列(通常這些序列存在基因間，長度200bp，多個拷貝)，通過PCR技術得到指紋圖譜，目前廣泛應用的包括了腸桿菌基因間重復共有序列(ERIC)[15]。由于ERICPCR方法的有效性、簡易性、快速性、靈敏性和可重復性，使它成為細菌鑒別和細菌分類的分子遺傳分析的有力工具[16]。

采用不同的選擇性培養基對宜賓芽菜中乳酸菌進行分離篩選，運用16S rDAN PCR-RFLP和ERIC-PCR相結合的方法對乳酸菌進行遺傳多樣性的研究，通過16S rDNA序列分析對芽菜中乳酸菌菌相和系統發育進行了分析。揭示了宜賓芽菜中乳酸菌菌相組成，同時也證明了這幾種分子生物學方法是乳酸菌菌相分析的有效方法。

3.2 本實驗中兩種標記方法得到的分析樹狀圖結果基本一致，相同樣品的菌株聚在一起，如ERIC-PCR分析樹狀圖中群Ⅱ與16S rDNA PCR-RFLP分析樹狀圖的類群Ⅲ菌株組成完全相同。但也存在差異，造成這些差異的原因主要有兩方面。首先，是兩種分子標記方法所擴增的基因不同，16S rDNA RFLP-PCR是檢測DNA在限制性內切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小；而ERIC-PCR擴增的是兩個相鄰的ERIC保守序列之間的區域，由于不同的菌株基因上的ERIC重復序列的數目和分布不同，從而得到由一系列大小不同片段組成的DNA指紋圖譜。其次，供試菌株基因組特點使得兩種方法的樹狀分析圖在不同的相似度下對菌株的遺傳類型鑒別程度產生差異。如16S rDNA PCR-RFLP分析樹狀圖中，在83%相似水平處被分為4個遺傳群，ERIC-PCR分析樹狀圖中，在73%的相似水平下分為4個分支，說明后者能在更低的相似度下將菌株分為不同的遺傳群，即16S rDNA PCR-RFLP能更好地將供試菌株的遺傳類型分開。

3.3 通過16S rDNA PCR-RFLP和16S rDNA序列分析可得：加糖腌制3個月的甜芽菜(樣品B)和腌制2個月的白芽菜(樣品C)中乳酸菌以腸球菌屬(Enterococcus)為主，腌制1a的白芽菜(樣品A)中乳酸菌主要是片球菌屬(Pediococcus)和乳桿菌屬(Lactobacillus)，從結果可知，不同腌時期對乳酸菌的種類有很大影響，在腌制初期，以堅強腸球菌(E.durans)構成腸球菌(Enterococcus)為主，而腌制中后期主要以植物乳桿菌(L.plantarum)組成的乳桿菌屬(Lactobacillus)和由戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)構成片球菌屬(Pediococcus)為主。

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Isolation, Selection and Analysis of Lactic Acid Bacteria (LAB) in Sichuan Yibin Pickled Mustard Vein

YIN Xi1，PU Biao1,*，CHEN An-jun1，AO Xiao-lin1，ZHANG Xiao-ping2
(1. College of Food Science, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China；2. College of Resource and Environmental Science, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China)

Six kinds of selective media were used to isolate lactic acid bacteria from Sichuan Yibin pickled mustard vein. The pH of the strain was lower more than 4.0 in MRS broth for 72 h cultivation and Rf value was similar to standard sample of lactic acid bacteria selected for follow-up tests. PCR-RFLP and ERIC-PCR of 16S rDNA were used to analyze the genetic diversity of strains. Sequence analysis of 16S rDNA was used to analyze the microflora and phylogeny of lactic acid bacteria in Yibin pickled mustard vein. PCR-RFLP and ERIC-PCR of 16S rDNA analysis showed that lactic acid bacteria were rich in genetic diversity. Based on the fingerprint of 16S rDNA PCR-RFLP and ERIC-PCR products, representative strains were selected to construct the phylogenetic tree and the results showed that the dominant lactic acid bacteria in Yibin pickled mustard vein were Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus plantarum and Eenterococcus durans.

Yibin pickled mustard vein；lactic acid bacteria；microflora；16S rDNA PCR-RFLP；ERIC-PCR

TS201.3

A

1002-6630(2013)03-0163-06

2011-10-20

國家自然科學基金項目(31171726)；“十二五”國家科技支撐計劃項目(2012BAD31B04)；四川省科技支撐計劃項目(2010NZ0045)

尹曦(1986—)，女，碩士研究生，研究方向為食品微生物與發酵工程。E-mail：492917614@qq.com

*通信作者：蒲彪(1956—)，男，教授，博士，研究方向為果蔬加工、功能性食品。E-mail：pubiao2002@yahoo.com.cn