丹酚酸B對小鼠體外血小板P-選擇素的作用

林志堅，曾文雙，吳 軍

阿司匹林、氯吡格雷及西洛他唑是臨床上最常用于缺血性心腦血管病預防和治療的抗血小板藥物。然而，這些藥物存在一定的副作用，如消化道出血甚至顱內出血，而且還可能會出現抗血小板藥物抵抗［1］。近年來，國外學者開始研發新型抗血小板藥物［2］，如三氟柳、Parsugrel、坎格雷洛等，這些新型抗血小板藥物價格昂貴、臨床應用經驗不成熟，而且仍然不能克服出血的副作用。傳統中藥丹參被證實可以有效地抑制血栓形成［3］，且無明顯副作用，價格低廉，但丹參各種成分的抗血栓機制尚未明確。丹酚酸B（salvianolic acid B，SA-B）是丹參最主要的水溶性有效成分，在丹參總酚酸中含量最高，約占70%。本研究利用流式細胞技術測定血小板膜P-選擇素陽性百分率的方法，觀察不同濃度SA-B對經膠原作用的小鼠體外血小板膜P-選擇素表達的影響，探討SA-B對小鼠血小板活化功能的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及分組 雄性昆明小鼠（8周齡，體重35 g～40 g），清潔級，50只，由南方醫科大學實驗動物中心提供，隨機分為5組：對照組，模型組，低濃度SA-B組、中濃度SA-B組、高濃度SA-B，每組10只。

1.1.2 主要藥品及試劑 丹酚酸-B，淡黃色粉針劑，純度大于98%，中國藥品生物制品檢定所／臨用前用生理鹽水配制成不同濃度：1 200 mg／L，2 400 mg／L，3 600 mg／L；膠原（美國 Sigma公司產品）；藻紅蛋白標記的抗小鼠IgG（IgG-PE），異硫氰酸熒光素標記的抗小鼠CD61單克隆抗體（CD61-FITC），藻紅蛋白標記的抗小鼠CD62P單克隆抗體（CD62P-PE）（美國BD公司）。

1.1.3 主要儀器 流式細胞儀（Epics XL型，美國Beckman Coulter公司），隔水式恒溫培養箱（型號GNP-9160，上海雷韻試驗儀器制造公司）。

1.2 方法

1.2.1 采血 采用眼球摘除法取全血于3.8%枸櫞酸鈉抗凝EP管中。

1.2.2 膠原激活 取對照組小鼠全血10μL加入生理鹽水10 μL（分別取2管），混勻，37℃孵育15 min；分別取其余各組小鼠全血10μL加入200μg／m L膠原10μL（美國Sigma公司，膠原終濃度為100μg／m L，分別取2管），混勻，37℃孵育15 min。

1.2.3 藥物作用 在低濃度SA-B組全血加入1 200 mg／L SA-B 10μL（SA-B終濃度為400 mg／L），在中濃度SA-B組加入2 400 mg／L SA-B 10μL（SA-B終濃度為800 mg／L），在高濃度SA-B組加入3 600 mg／L SA-B 10μL（SA-B終濃度為1 200 mg／L），模型組加入等量的生理鹽水，37℃孵育30 min。

1.2.4 流式細胞檢測 在上述經過處理的標本中，對照管加入抗小鼠CD61-FITC、抗小鼠IgG-PE，試驗管加入抗小鼠CD61-FITC、CD62P-PE。混勻室溫避光孵育20 min，然后再加入1 mL冷的磷酸緩沖液（PBS）。采用流式細胞儀檢測，以CD61-FITC和側散射光散點圖設血小板門，測定血小板膜CD62P（P-選擇素）表達陽性百分率。

1.3 統計學處理 采用SPSS 17.0進行分析，數據以均數±標準差（±s）表示，多個樣本均數比較采用單因素方差分析（one way ANOVA），組間均數比較采用LSD-t檢驗。

2 結 果

模型組P-選擇素高于對照組（P＜0.01）；低濃度SA-B組、中濃度SA-B組、高濃度SA-B組P-選擇素均低于模型組（P＜0.05）；不同濃度SA-B組P-選擇素隨SA-B濃度的增加而減少（P＜0.05）。詳見表1。

表1 各組小鼠P-選擇素的比較（±s） %

表1 各組小鼠P-選擇素的比較（±s） %

組別 n P-選擇素對照組10 9.37±1.29模型組 10 53.79±5.781）低濃度SA-B組 10 48.24±4.662）中濃度SA-B組 10 44.67±2.382）3）高濃度SA-B組 10 40.24±6.092）3）4）與對照組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.05；與低濃度SA-B組比較，3）P＜0.05；與中濃度SA-B組比較，4）P＜0.05

3 討 論

傳統中藥丹參被證實可以有效抑制血栓形成，對心血管、神經細胞具有保護作用，且無明顯副作用，價格低廉，廣泛應用于治療缺血性心腦血管疾病［3］。丹參的主要化學成分包括脂溶性的丹參酮類化合物和水溶性的酚酸類化合物，丹參各種成分的抗血栓機制尚未明確［4］。丹酚酸B是丹參最主要的有效活性成分［5］。

靜息狀態下，P-選擇素主要存在于血小板α顆粒內，血小板活化后，α顆粒與血小板質膜融合，P-選擇素表達血小板質膜表面［6］，成為血小板活化的一個特征性指標。本研究發現，加入膠原后，血小板膜P-選擇素陽性率明顯升高，提示膠原可刺激血小板活化。膠原是啟動血小板黏附、聚集過程最強有力的血管壁成分。血小板有2個受體在血小板-膠原相互作用起重要作用，即糖蛋白Ⅵ（GPⅥ）和整合素α2β1。血小板特異性GPⅥ（62 k Da）是血小板膠原特異的信號轉導蛋白，它與膠原的親和力低，不能單獨介導穩定的血小板黏附，但對血小板穩定的黏附到膠原上起關鍵作用，因為它通過結合的FcRγ鏈誘導強大的信號途徑；整合素α2β1經過活化后由低親和力構象轉化為高親和力構象，膠原結合到整合素α2β1促進血小板活化和緊密黏附途徑的下游步驟的進行。

本研究發現不同濃度的SA-B組P-選擇素均低于模型組，P-選擇素隨SA-B濃度的增加而減少，不同濃度的SA-B對膠原引起的血小板活化具有抑制作用，SA-B濃度越高，這種抑制作用越強。因此，可以認為，SA-B抗血栓的機制可能與其抑制膠原引起的血小板活化有關。另外，P-選擇素與其配體結合后起信號轉導作用，活化靶細胞或改變其功能狀態，從而介導白細胞-內皮細胞、白細胞-血小板間反應，最終導致組織損傷［7］，SAB對P-選擇素具有抑制作用，減少炎癥反應對心血管、神經細胞的損傷。

本研究的不足之處在于僅測定P-選擇素，而未檢測血小板膜糖蛋白GPⅡb／Ⅲa纖維蛋白原受體。目前標記小鼠GPⅡb／Ⅲa纖維蛋白原受體的熒光抗體為JON／A-PE或JON／A-FITC［8］，該試劑價格較為昂貴且不易獲得，這是本研究不能檢測GPⅡb／Ⅲa纖維蛋白原受體的原因。GPⅡb／Ⅲa與纖維蛋白原的結合是血小板聚集的最后通路［9］。GPⅡb／Ⅲa與纖維蛋白原結合，引起血小板聚集，促進血栓形成，在腦缺血缺氧性損傷起重要的作用。

［1］ Linden MD，Tran H，Woods R，et al.High platelet reactivity and antiplatelet therapy resistance［J］.Semin Thromb Hemost，2012，38（2）：200-212.

［2］ Briasoulis A，Tousoulis D，Bakogiannis C，et al.Novel anti-platelet agents for the treatment of stable angina pectoris［J］.Curr Pharm Des，2013，19（9）：1581-1586.

［3］ 方芳，王平珍，段蕓.中藥丹參的臨床應用進展［J］.內蒙古中醫藥，2012，31（19）81-82.

［4］ 鄧翠娥.丹參的藥理作用與臨床應用研究進展［J］.時珍國醫國藥，2003，14（12）：776-777.

［5］ Ho JH，Hong CY.Salvianolic acids：Small compounds with multiple mechanisms for cardiovascular protection［J］.J Biomed Sci，2011，18：30.

［6］ Merten M，Thiagarajan P.P-selectin in arterial thrombosis［J］.Z Kardiol，2004，93（11）：855-863.

［7］ Htun P，Fateh-Moghadam S，Tomandl B，et al.Course of platelet activation and platelet-leukocyte interaction in cerebrovascular ischemia［J］.Stroke，2006，37（9）：2283-2287.

［8］ Bergmeier W，Schulte V，Brockhoff G，et al.Flow cytometric detection of activated mouse integrin alphaⅡbbeta3 with a novel monoclonal antibody［J］.Cytometry，2002，48（2）：80-86.

［9］ Schneider DJ.Anti-platelet therapy：GlycoproteinⅡb-Ⅲa antagonists［J］.Br J Clin Pharmacol，2011，72（4）：672-682.