孕中晚期胎兒細胞遺傳學的診斷分析

黃曙方，李 萍，丁 紅，劉 珍，肖定璋，陳 景，陳少賢，孟錦繡，余細勇

由于目前遺傳病尚無有效的治療方法，在出生前對胎兒進行檢查，降低遺傳病的發生對家庭、社會造成的危害顯得尤為重要。隨著產前診斷的廣泛開展，預防了大量的嚴重先天性出生缺陷兒的出生。細胞遺傳學診斷是應用最廣泛且非常準確的產前診斷方法，最常用的為羊水及臍血染色體的產前診斷。現對2003年6月—2011年12月進行細胞遺傳學產前診斷的1 945例病例進行分析，探討染色體異常與年齡、孕周、手術指征、手術方式、胎兒結局等臨床特點的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇在我院接受產前診斷有指征的孕婦1 956例，孕婦年齡20～45歲，孕周為16～39周，其中16～23+6周者1 270例，24周及以上者686例。經知情同意簽字后行羊膜腔穿刺或臍血管穿刺。

1.2 方法

1.2.1 羊水培養及染色體分析的方法 16～23+6周者行羊水穿刺，24周及以上者行臍血管穿刺。在無菌條件下B超定位后行羊膜腔穿刺術，開始1 ml羊水棄去，再抽取羊水20～25 ml分裝3支Falcon無菌離心管中1 800 r/min離心10 min，棄上清，每管留細胞沉淀及羊水0.5～1.0 ml，置于4 ml羊水完全培養基(GIBCO的A mino MAXTM-Ⅱ Complete，或以色列的BIO-AMF-2)，37 ℃ 5%CO2培養箱中靜止培養5～7 d后，在倒置顯微鏡下觀察，出現散在梭狀細胞貼壁生長，則換液。以后每天觀察，當有3個以上較大克隆(5倍鏡下克隆占滿整個視野)且克隆中有較多透亮的圓形細胞時即可收獲。在收獲前3～4 h加入秋水仙素，用0.5% trypsin-EDTA消化3 min左右，專用刮刀刮下細胞，2 000 r/min離心，棄上清，0.075 mol/L氯化鈉低滲15 min，用3∶1甲醇∶冰醋酸預固定和固定后，滴片，常規G顯帶。每例標本按照ISCN(1995)標準，油鏡下數20～30個中期分裂象，發現異?；蚯逗象w翻倍，必要時臍血染色體再次確認，分析5個核型。

1.2.2 臍血培養及染色體分析方法 在超聲引導下行臍血管穿刺術，取臍血2 ml，置于肝素鈉抗凝的一次性取血管中，取0.5 ml接種于“益生菌”細胞培養液(5 ml)，每例接種2瓶，37 ℃培養72 h后加入秋水仙素，2 h后收獲，收獲、制備染色體標本、分析、計數同羊水。

2 結果

2.1 手術指征 孕中晚期胎兒染色體檢查總病例為1 956例，手術指征分為6大類(6類指征的病例之間無交叉)：(1)高齡，927例，占47.4%，其中染色體異常24例(如同時高齡且血清學異常，取高齡作為首要指征)。(2)血清學篩查異常，564例，占28.8%，其中染色體異常13例。(3)B超異常，331例，占16.9%，其中染色體異常30例。(4)不良生育史，74例，占3.8%(多數不良生育史有高齡，均歸為高齡指征內)。(5)父母一方為染色體異常攜帶者，10例，占0.5%，其中染色體異常5例。(6)其他原因50例，占2.6%。

2.2 細胞培養結果 羊水培養成功1 267例，培養成功率99.8%；臍血培養成功678例，培養成功98.8%，共1 945例。細胞培養失敗例數11例，占總例數0.6%，具體情況見表1。

2.3 染色體核型分析 發現胎兒異常核型74例，其中羊水34例，臍血40例，具體情況見表2、3。其中21三體29例(占異常核型74例的39.2%)(包含3例嵌合體)；13三體4例(5.4%)；18三體11例(14.9%)；45，X 5例(6.8%)；47，XXX 3例(4.1%)；47，XYY 3例(5.4%)(其中有1例嵌合體)；含有標志染色體mar的嵌合染色體2例(2.7%)(1例46，XX，嵌合的mar證實為部分18號染色體；另1例45，X，嵌合的mar證實為部分Y染色體)；其他異常染色體18例(24.3%)。非整倍體染色體(數目異常)共56例，占異常染色體的75.7%。

表1 11例細胞培養失敗病例的具體情況

表2 34例羊水異常染色體核型患者的具體情況

表3 40例臍血異常染色體核型患者的具體情況

發現胎兒染色體異態性101例(占培養成功1 945例的5.2%)。其中46，XN，inv(9)27例(占異態總例數101例的26.7%)；46，XY，Yqh+ 31例(30.7%)；46，XY，Yqh- 1例(1.0%)；其他次縊痕及隨體異態42例(41.6%)。

2.4 染色體異常的妊娠結局 本研究中發現胎兒異常核型74例(占培養成功1 945例的3.8%)。因染色體異常終止妊娠58例，占異常染色體的78.4%。廣東省人民醫院自2003年后恢復開展介入性產前診斷，至2011年，共穿刺1 956例。其中穿刺術后早產1例，胎死宮內1例，手術相關妊娠丟失率為0.1%。

3 討論

本研究在發現的胎兒異常染色體中，由羊水檢出的共34例，占羊水的2.7%；臍血檢出異常40例，占臍血檢查的5.9%。臍血的染色體異常率高于羊水，推測可能與手術指征有關。由表格可看出抽取羊水檢查的手術指征多為高齡、唐氏篩查高風險，而抽取臍血檢查的手術指征以B超異常為主。越來越多研究表明，超聲在染色體異常的檢出中起著非常重要的作用。國外有研究發現48%產前超聲異常胎兒通過產前診斷證實存在染色體異常[1]。國內有研究甚至發現因超聲胎兒結構異常而行胎兒染色體檢查的染色體異常率最高，高達50%[2]。在本研究中共有56例數目異常，因B超異常而行染色體的共計26例，其中21三體(包括嵌合)8例，占該病例的27.6%(74例染色體異常中21三體共29例，其中8例是B超發現的異常而行產前診斷)；13三體3例，占該病例的75%(74例中13三體共有4例，有三例是B超發現的)；18三體(包括嵌合)7例，占該病例的63.6%(74例中11例18三體，由B超發現的有7例)；特納氏綜合征(包括嵌合)4例，占該病例的100%(74例中45，X有 4例均由B超發現)；47，XXY 1例，占該病例的33.3%(74例中47，XXY有3例，1例由B超發現)；47，XYY 1例，占該病例的33.3%(74例中47，XYY有3例，1例由B超發現)；嵌合mar 2例，占該病例的100%(2例均由B超發現而行產前診斷)。由此可見，超聲在胎兒非整倍體的檢出中非常敏感，國外也多有研究，對非整倍體染色體病超聲診斷也形成一致的診斷標準[3]。在18三體、13三體及性染色體數目異常中尤其表現出突出的作用。而在21三體的檢出中占的比例相對較低，可能原因是在因高齡、唐氏篩查高風險已檢出大部分，且該病特征是以智力低下為主，外觀的異常及臟器畸形并不太突出，非常有經驗的B超醫生才能發現軟指標異常，提示須行胎兒染色體檢查。對于在24周前已有指征(如高齡、唐氏篩查高風險)而不愿意做產前診斷的孕婦，在孕中后期詳細的B超檢查起到了很好的把關作用，減少了許多的出生缺陷兒的出生。

在我院產前診斷的細胞培養成功率是較高的。其中羊水培養成功率99.8%；臍血培養成功率98.8%。均超過衛生部及衛生廳的要求，也高于國內的一般水平[4-5]。對此筆者也有些心得。在培養羊水的過程中，換液時將棄液繼續留下培養，如果第一批細胞最后制片后可分析的分裂相少，則棄液可種下1周左右換液，換液2 d后再次收獲，還有機會得到理想的效果，成功發出報告。因此本研究的羊水培養成功率是較高的。臍血培養失敗8例，有5例是胎兒水腫，推測可能因為水腫導致培養的條件的改變而培養失敗。

本研究中胎兒染色體異常率為3.8%，與文獻報道接近[6-7]。高于新生兒染色體異常率7‰[8]。可能原因為需介入性產前診斷的孕婦均有高危因素，且有染色體異常兒，在孕期可能會出現流產、早產、死產、胎死宮內、引產等情況，使得胎兒染色體異常的檢出率高于新生兒。

本研究中共有14例平衡易位的胎兒(0.71%)，略高于臺灣學者的一項研究報道(0.53%)[9]。除1例有嚴重的唇腭裂引產外，其余分娩，追蹤結局新生兒外觀均正常。在這14例平衡易位胎兒，有5例因為雙親一方有平衡易位而手術。另外9例因高齡、唐氏篩查高風險、B超異常而行介入性產前診斷手術，追蹤家系有2例與父母無關，余7例均遺傳自父母。在此1 956例中，有10例因雙親之一染色體異常手術，胎兒染色體異常5例，染色體異常率在各手術指征中最高，為50%，與文獻報導相似。因此在夫婦多次自然流產后需行染色體檢查，及時發現異常，在孕中期必須行產前診斷[10]，如與親代染色體核型一致，致畸的風險較低[11]，可繼續妊娠。如平衡易位為新發，則B超監測顯得尤為重要。因為在易位過程中，可能會有一些微小的遺傳物質的缺失和重排，而常規G顯帶染色體檢查不能發現，但B超可觀察到胎兒畸形。值得注意的是除了發現染色體數目異常外，在發現其他染色體異常(如異態性、平衡易位等)時，首先并不是急于建議引產，而應行父母雙方的染色體檢查，結合B超檢查才給孕婦指導意見。

近十年廣東省人民醫院進行有針對性的胎兒染色體檢測，極大地減少了出生缺陷兒的出生，對避免許多家庭悲劇，減輕社會負擔做出不小的貢獻。但是在工作中也發現，介入性產前診斷在社會中的宣傳普及也有很多不夠之處，許多孕婦及其家人對產前診斷的認識不足或片面，只著重于手術的風險而對染色體病的危害視而不見；而許多臨床醫生對產前診斷手術指征的把握尚不清晰。在全社會宣傳產前診斷是優生優育的重要手段，使產前診斷的必要性深入民心，仍需醫務工作人員乃至全社會共同努力。

1 Boyd PA，Rounding C，Chamberlain P，et al.The evolution of prenatal screening and diagnosis and its impact on an unselected population over an 18-year period[J].BJOG，2012，119(9)：1131-1140.

2 毛倩倩，魯莉萍，陳鐵峰，等.不同指征介入性細胞遺傳學診斷探討[J].中國衛生檢驗雜志，2012，22(2)：312-315.

3 Chitayat D，Langlois S，Wilson RD.Prenatal screening for fetal aneuploidy in singleton pregnancies[J].J Obstet Gynaecol Can，2011，33(7)：736-750.

4 蔣群芳，唐娟.桂林地區526例遺傳咨詢者羊水細胞染色體核型分析[J].中國優生與遺傳雜志，2012，20(1)：31-32.

5 文錦麗，曾君，林秀華，等.產前診斷266例胎兒臍帶血染色體檢測結果分析[J].中國優生與遺傳雜志，2012，20(4)：36-37.

6 潘小英，鐘燕芳，傅文婷，等.3405例產前診斷的指證及其結果評價[J].生殖與避孕，2008，28(5)：268-272.

7 賈政軍，彭向京，胡蓉，等.6410例胎兒染色體核型分析及在產前診斷中的臨床意義[J].實用預防醫學，2012，19(1)：52-83.

8 陳竺.醫學遺傳學[M].北京：人民衛生出版社，2005：7.

9 Peng HH，Chao AS，Wang TH，et al.Prenatally diagnosed balanced chromosome rearrangements：eight years′ experience[J].J Reprod Med，2006，51(9)：699-703.

10 劉慈，尹紅亞，劉學軍，等.熒光原位雜交技術快速產前診斷胎兒常見染色體非整倍體異常研究[J].中國全科醫學，2010，13(12)：3976.

11 Park S，Lee BY，Kim YM，et al.De novo chromosomal aberrations in the fetus；genetic counseling and clinical outcome[J].J Korean Med Sci，2003，18(3)：397-401.