正常T細胞表達和分泌的活性調節蛋白基因啟動子-403G/A多態性與2型糖尿病并發糖尿病腎病的相關性研究

吳廣飛，張運捷，劉博偉，陸 強，尹福在，陳莉明

糖尿病腎病(DN)是糖尿病(DM)最常見的微血管并發癥之一，其發病機制還不很清楚。正常T細胞表達和分泌的活性調節蛋白(RANTES)屬于趨化因子家族，RANTES在體內分布廣泛，腎臟系膜細胞及腎小管上皮細胞等均可產生RANTES,趨化單核-巨噬細胞、T細胞炎癥和免疫反應，參與腎小球硬化和腎間質纖維化。RANTES基因啟動子存在-403G/A突變，已證實基因突變提高了基因表達水平[1]，其與DN的相關研究國內外報道較少。本研究對中國天津地區漢族人群中RANTES基因啟動子-403G/A變異進行基因分型，探討其與2型糖尿病(T2DM)并發DN風險的關系。

1　對象與方法

1.1研究對象選取2004年6—10月天津醫科大學代謝病醫院住院的T2DM患者 244例為研究對象，其中男118例，女126例；年齡36～82歲，平均(62.3±9.9)歲；體質指數(BMI)(24.5±3.2)kg/m2。T2DM診斷依據1999年世界衛生組織(WHO)DM診斷標準。DM診斷病程均在8年以上，血漿肌酐水平<1.5 mg/dl(133 μmol/L)。排除糖尿病急性并發癥、合并感染、繼發性糖尿病，據病史排除原發性腎小球腎炎、系統性紅斑狼瘡(SLE)、藥源性間質性腎炎、慢性腎盂腎炎等腎臟疾病，B超排除多囊腎。依據2～6個月內至少兩次24 h尿清蛋白排泄率(AER)水平，分為3組：<20 μg/min為正常清蛋白尿組(DN0組)；20～200 μg/min為微量清蛋白尿組(DN1組)；>200 μg/min為臨床清蛋白尿組(DN2組)。

1.2方法

1.2.1病史詢問及體格檢查由專人對受試者進行詳細病史詢問并填表，空腹測量身高、體質量、收縮壓(SBP)及舒張壓(DBP),并計算BMI，記錄血總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、纖維蛋白原(FIB)及糖化血紅蛋白(HbA1c)水平。

1.2.2受試者基因組DNA提取應用蛋白酶K快速裂解消化法提取基因組DNA，經紫外分光光度法測定OD值，計算DNA濃度。

1.2.3RANTES基因啟動子-403G/A多態性測定RANTES基因啟動子-403G/A上游引物為5′-CACAAGAGGACTCATTCCAACTCA-3′；下游引物為5′-GTTCCTGCTTATTCATTACAGATCgTA-3′(g引入酶切消化位點)，由Takara公司合成(PAGE純化，純度>99%)。限制性核酸內切酶(RsaⅠ)購自美國Promega公司，由北京鼎國生物技術有限責任公司代理,RsaⅠ識別序列：5′…GT▼AC…3′、3′…CA▼TG…5′，聚合酶鏈反應(PCR)體外擴增目的基因片斷，反應體系25 μl，反應參數如下：94 ℃預變性5 min，然后94 ℃變性30 s、59 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min進行45個循環。1.5%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產物。酶切反應體系20 μl，將反應體系充分混勻，37 ℃水浴反應120 min后，2.5%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切產物。選取應用RFLP鑒定的RANTES-403G/A基因型為GG、GA、AA的DNA模板，分別擴增90 μl的PCR產物，送至上海申能博彩生物科技有限公司純化、直接測序。

1.3統計學方法采用SPSS 11.5統計軟件分析數據，計量資料采用One-Sample K-S test 檢驗正態分布，3組間比較用方差分析(ANOVA)及LSD-t檢驗進行組間比較；計數資料采用R×Cχ2檢驗，組間比較應用χ2分割法；采用Logistic逐步回歸分析DN的危險因素。以P<0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1PCR擴增產物鑒定OD260/OD280>1.6，說明DNA的純度好，計算DNA的濃度在200 ng/μl左右。應用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳可見，目的基因擴增產物較好(見圖1)。

2.2PCR擴增產物的RFLP鑒定擴增產物經RsaⅠ消化后，G/G基因型酶切后產生180 bp和20 bp的片斷，G/A基因型酶切后產生206 bp、180 bp和20 bp的片斷，A/A基因型酶切后仍為206 bp。20 bp的片斷太小，凝膠中未見到(見圖2)。

2.33組間一般情況及生化指標比較3組間性別構成、年齡、BMI、HbA1c、TG水平比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。DN1組病程、SBP、DBP水平高于DN0組，HDL-C水平低于DN0組；DN2組SBP、DBP、LDL-C、FIB水平高于DN0和DN1組，DN2組病程高于DN0組，DN2組TC、HDL-C水平高于DN1組，差異均有統計學意義(P<0.05，見表1)。

表1　3組一般情況及生化指標比較

注：BMI=體質指數，HbA1c=糖化血紅蛋白，SBP=收縮壓，DBP=舒張壓，TC=總膽固醇，TG=三酰甘油，LDL-C=低密度脂蛋白膽固醇，HDL-C=高密度脂蛋白膽固醇，FIB=纖維蛋白原；與DN0比較，*P<0.05；與DN1比較，△P<0.05；▲為χ2值

注：1～7為目的基因擴增產物206 bp，8為100 bp DNA Ladder Marker

圖1PCR擴增產物1.5%的瓊脂糖凝膠電泳結果

Figure1Result of PCR amplification product by 1.5% agarose gel electrophoresis

注：1、2電泳條帶為206 bp,基因型為RANTES-403A/A；3、4電泳條帶為206 bp、180 bp,基因型為RANTES-403G/A；5、6電泳條帶為180 bp,基因型為RANTES-403G/G；7為100 bp DNA Ladder Marker

圖2酶切產物經2.5%瓊脂糖凝膠電泳結果

Figure2Result of enzyme product by 2.5% agarose gel electrophoresis

2.43組基因型及等位基因頻率比較3組基因型及等位基因頻率分布均符合Hardy-Weinberg定律。DN0組、DN1組及DN2組基因型頻率比較，差異有統計學意義(χ2=9.801,ν=4,P=0.040)。組間比較應用R×C分割法,DN0與DN1組基因型頻率比較差異無統計學意義(χ2=1.705,ν=2,P=0.426)。將DN0與DN1組合并，與DN2組基因型頻率比較差異有統計學意義(χ2=8.245,ν=2,P=0.016，見表2)。

DN0組、DN1組及DN2組等位基因頻率比較，差異有統計學意義(χ2=7.613,ν=2,P=0.022)。組間比較應用R×C分割法,DN0與DN1組等位基因頻率比較差異無統計學意義(χ2=0.066,ν=1,P=0.798)。將DN0與DN1組合并,A等位基因頻率低于DN2組，差異有統計學意義(χ2=7.552,ν=1,P=0.006，見表2)。

2.5DN危險因素的Logistic回歸分析DN0組為無DN組,DN1+DN2組為有DN組,以RANTES-403G/A的基因型、性別、病程、SBP、DBP為自變量,以有無DN為因變量,進行Logistic回歸分析,結果顯示RANTES-403A(+)的基因型、病程、SBP與T2DM并發DN有回歸關系(見表3)。

表23組基因型及等位基因頻率比較〔n(%)〕

Table2Comparison of respective frequency of genotype and allele in the three groups

組別例數基因型頻率GG　　　　GA　　　　AA等位基因頻率G　　　　　　　ADN08651(593)23(267)12(140)125(727)47(273)DN18445(536)30(357)　9(107)　120(714)48(286)DN27427(365)34(459)13(176)　88(595)　60(405)

表3　DN危險因素的Logistic回歸分析結果

3　討論

炎癥反應參與了DN的病理生理過程，有研究顯示，血管緊張素轉換酶抑制劑(ACEI)及血管緊張素受體阻斷劑(ARB)具有抗炎作用，可抑制某些炎性因子，如單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)及RANTES表達，甚至逆轉Ⅲ期DN，但由于缺乏有針對性的抗炎治療，Ⅳ期DN尚無有效藥物治療，仍有20%Ⅳ期DN患者發展至終末腎衰竭(EASD)[2]。

RANTES屬于趨化因子家族，在低濃度水平時，即具有典型的趨化作用，通過G蛋白偶聯受體介導信號轉導，使單核細胞、T細胞等沿其濃度梯度遷移，在高濃度水平時,還可通過蛋白酪氨酸(PTK)介導信號轉導。另外，RANTES還可激活JAK、p38MAP激酶，上調多種信號轉導[3]。

RANTES啟動子區存在-403G/A、-28C/G兩個多態性位點，已證實，基因突變增加了RANTES的表達水平[1]，有研究顯示，Ⅲ期DN患者尿液MCP-1和RANTES水平均提高，且RANTES水平與HbA1c相關[4]，高血糖可以通過糖基化終末產物刺激RANTES表達。Mezzano等[5]通過腎活檢研究了11例Ⅳ期DN患者，觀察到了MCP-1和RANTES表達上調，主要在腎小管細胞，而且，在同樣的細胞，MCP-1和RANTES上調與核因子κB(NF-κB)的活性密切相關。另外，腎小管上皮細胞表達MCP-1和RANTES與蛋白尿量和腎間質炎性細胞浸潤程度密切相關。

DN大鼠實驗同樣發現巨噬細胞介導了腎損傷，巨噬細胞的募集和激活與高血糖及HbA1c、清蛋白尿和血肌酐水平升高有關，與系膜細胞MCP-1、RANTES、遷移抑制因子(MIF)、單核細胞單克隆刺激因子表達有關,巨噬細胞參與了腎小球的硬化，促進了DN的進展[6]。

日本學者Nakajima等[7]應用聚合酶鏈反應-限制片斷長度多態性(PCR-RFLP)法首次對RANTES基因啟動子區-403G/A、-28C/G兩個位點基因多態性與T2DM并發DN的關系進行了研究,結果顯示RANTES啟動子-403G/A基因多態性與DN無關，-28 G(+)的基因型與DN有關，可能是DN的獨立危險因素。Nakajima在研究對象的入選上沒有限制病程，大量清蛋白尿組病程高于微量清蛋白尿和正常清蛋白尿組，但研究對象616例，考慮到微量清蛋白尿組患者由于血壓和血糖的暫時影響，一部分患者可能進入正常清蛋白尿組和大量清蛋白尿組，正常清蛋白尿組由于病程的影響，一部分患者可能進入微量清蛋白尿組，Nakajima剔除微量清蛋白尿組，限定病程>10年的患者，進行正常清蛋白尿組和大量清蛋白尿組的比較，得出了相同的結論。

本研究結果顯示，RANTES啟動子-403G/A基因多態性與DN存在關聯性，DN0組、DN1組及DN2組間無論是GG、GA、AA基因型頻率之間還是A(+)的基因型與A(-)的基因型頻率之間均有差異，這與Nakajima的結果不一致，可能由于基因分布的種族差異、研究對象的入選及其他未知因素所致。進行組間比較時，DN0組與DN1組比較無差異，另外，DN0組中部分患者可能處于DNⅠ期或Ⅱ期，進行了DN0組與DN1組的合并，與DN2組比較，得出了相同的結論。李會芳等[8]探討了RANTES基因啟動子區-28C/G基因多態性與中國昆明地區漢族人DN的相關關系，結果顯示-28G等位基因頻率在對照組、正常清蛋白尿組、微量清蛋白尿組及大量蛋白尿組中分別為6.0%、7.8%、8.6%和8.6%,得出此位點與DN不相關的結論，這與Nakajima的結果也不一致。然而，張松等[9]研究T2DM 143例，結果顯示RANTES基因啟動子-28G陽性基因型與DN相關，與Nakajima的結果一致。由于-28G等位基因頻率在中國人群中的分布較低，擴大樣本研究結果更可靠。Joo等[10]研究了177例DN患者，結果卻顯示RANTES啟動子-403G/A、-28C/G基因多態性與DN均無關聯性。

許多研究已經證實，高血糖、高血壓、微量清蛋白尿、病程、年齡、男性、吸煙及遺傳因素等是DN的危險因素,為了避免由于病程引起的偏倚，本研究所選病例病程均>8年，但DN1組、DN2組病程高于DN0組，可見，隨病程延長，DN可能加重。有研究證實，微量清蛋白尿是冠心病的獨立危險因素，本研究提示，隨著DN進展，血壓、血脂控制更差，增加了動脈粥樣硬化進展。本研究樣本小，所選T2DM患者僅代表住院患者，結果有一定局限性，今后仍需擴大樣本進一步研究。另外，同時檢測血、尿RANTES水平更有意義。抗炎治療有望成為治療DN的一種新的手段,RANTES單克隆抗體、基因敲除及反義寡核苷酸技術的應用，使針對RANTES的治療可能成為治療DN的有效手段。

1Tavakkoly-Bazzaz J,Amiri P,Tajmir-Riahi M,et al.RANTES gene mRNA expression and its-403 G/A promoter polymorphism in coronary artery disease[J].Gene，2011，487(1):103-106.

2楊丕堅，李舒敏，呂以培，等.糖尿病腎病患者外周血T淋巴細胞亞群的變化及其與腎血管內皮功能障礙的關系[J].中國全科醫學，2011，14(11)：3779.

3Ruster C,Wolf G.The role of chemokines and chemokine receptors in diabetic nephropathy[J].Front Biosci,2008,1(13):944-955.

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5Mezzano S,Aros C,Droguett A,et al.NF-kappaB activation and overexpression of regulated genes in human diabetic nephropathy[J].Nephrol Dial Transplant,2004,19(10):2505-2512.

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7Nakajima K,Tanaka Y,Nomiyama T,et al.RANTES promoter genotype is associated with diabetic nephropathy in type 2 diabetic subjects[J].Diabetes Care,2003,26(3):892-898.

8李會芳,宋滇平,張敏,等.RANTES基因啟動子區-28C/G多態性與糖尿病腎病相關性研究[J].中華現代臨床醫學雜志,2004,2(5):673-675.

9張松，王睿，時立新.RANES基因啟動子基因多態性與2性糖尿病并發腎病的相關性[J].中國組織工程研究與臨床康復，2007,11(17)，3447-3449.

10Joo KW,Hwang YH,Kim JH,et al.MCP-1 and RANTES polymorphisms in Korean diabetic end-stage renal disease[J].J Korean Med Sci,2007,22(4):611-615.