單核細胞趨化蛋白-1和轉化生長因子β1及結締組織生長因子在2型糖尿病腎病大鼠腎組織中的表達

張亞莉，馮 婕，姜莎莎，李 燕，孫吉平，王慧芳，于琳華，郭尚武

糖尿病是最常見的慢性病之一，已成為嚴重的公共衛生問題[1]。隨著社會經濟的持續發展和人口的老齡化，我國糖尿病患病率近年來呈急劇升高趨勢，已成為糖尿病第一大國，且發病年齡趨于年輕化[2]。糖尿病腎病是糖尿病的嚴重慢性并發癥之一，嚴重危害著人類的健康及生命。最近有學者提出把糖尿病腎病看作是一種由代謝和免疫聯系起來的炎癥性疾病，在其發病過程中有很多細胞因子及炎性因子參與。筆者前期研究發現，環磷酰胺能夠減輕2型糖尿病腎病大鼠的蛋白尿及腎功能損害，并能使病理改變減輕，對糖尿病腎病具有保護作用[3]。本研究通過觀察單核細胞趨化因子-1(MCP-1)、轉化生長因子β1(TGF-β1)及結締組織生長因子(CTGF)在2型糖尿病腎病大鼠腎組織中的表達，了解早期糖尿病腎病發病過程中的炎癥反應及纖維化情況。

1　材料與方法

1.1實驗動物及試劑剛斷乳的3周齡SD雄性SPF級大鼠35只，體質量35～55 g，由西安交通大學醫學院動物實驗中心提供。鏈脲佐菌素(STZ)由美國Sigma化學公司生產，兔抗大鼠MCP-1、TGF-β1、CTGF由武漢博士德生物工程有限公司生產，二步法免疫組化檢測試劑由北京中杉金橋生物技術有限公司生產。各項實驗室指標的檢測均由我院中心實驗室完成。

1.2分組將35只大鼠適應性喂養1周，監測血糖均正常。采用隨機數字表法將大鼠分為對照組14只和糖尿病腎病組21只。對照組大鼠體質量為(45.5±6.1)g，糖尿病腎病組為(49.0±4.8)g，差異無統計學意義(t=-1.550，P>0.05)。

1.3糖尿病腎病動物模型的建立對照組大鼠每日給予常規飼料，糖尿病腎病組大鼠每日給予高脂飼料，兩組大鼠自由進食和飲水。8周后，采用單純隨機抽樣方法從兩組中各抽取6只大鼠，進行葡萄糖耐量試驗(OGTT)和同步胰島素釋放試驗，計算胰島素抵抗指數(HOMA-IR)，HOMA-IR=空腹血糖(FBG)×對應的空腹胰島素(FINS)/22.5[4]。第10周末，證實糖尿病腎病組大鼠存在胰島素抵抗后，兩組大鼠禁食不禁水12 h，糖尿病腎病組大鼠一次性腹腔注射STZ，35 mg/kg，對照組大鼠腹腔注射等量檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液[5-6]。給予STZ后3 d、7 d、14 d分別行尾靜脈采血檢測隨機血糖，以隨機血糖>15.7 mmol/L為糖尿病模型制備成功[6]。糖尿病腎病組中共18只大鼠成模，3只未成模者舍棄。第12周末，將兩組大鼠分別置于代謝籠中，收集尿液，檢測24 h尿蛋白定量，經統計學分析證明糖尿病腎病組大鼠24 h尿蛋白定量較對照組高，且注射STZ后較注射前高，說明糖尿病腎病動物模型制備成功(糖尿病腎病模型組共制備成功18只大鼠)，之后兩組大鼠均常規飼料喂養。

1.4標本收集第17周末，將兩組大鼠分別放入代謝籠中，收集24 h尿液并檢測24 h尿蛋白定量。大鼠稱體質量后，腹腔注射10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)麻醉，心尖部取血，離心分離血清，檢測尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)水平。4 ℃的0.9%氯化鈉溶液原位灌洗后迅速摘除左側腎臟，去除包膜，0.9%氯化鈉溶液沖洗后稱腎重，將腎標本切成1.0 cm×0.5 cm×0.5 cm大小組織塊，10%甲醛固定，石蠟包埋，常規連續切片，進行普通腎臟病理學染色，采用免疫組織化學法檢測腎組織中MCP-1、TGF-β1、CTGF的表達，采用Image-Pro Plus Version 6.0彩色圖像分析處理軟件進行圖像半定量分析，計算平均吸光度，平均吸光度=各視野下陽性吸光度(IA)/陽性面積(Area)。

2　結果

2.1HOMA-IR對照組HOMA-IR為(4.75±1.00)，糖尿病腎病組為(6.18±0.82)，差異有統計學意義(t=-2.698，P<0.05)。兩組大鼠0 min、30 min、60 min、120 min血糖水平比較，差異均無統計學意義(P>0.05)；0 min、30 min、60 min、120 min胰島素水平比較，差異均有統計學意義(P<0.05，見表1)。

2.224 h尿蛋白定量及血糖兩組大鼠注射STZ前24 h尿蛋白定量比較，差異無統計學意義(P>0.05)，注射第14天比較，差異有統計學意義(P<0.01)。重復測量的方差分析結果顯示，注射STZ后3、7、14 d兩組血糖水平比較，差異有統計學意義(P<0.01，見表2)。

2.3免疫組織化學對照組大鼠腎小管可見少量MCP-1表達，著色較淺(見圖1A)；糖尿病腎病組大鼠腎皮質近端腎小管刷狀緣可見MCP-1表達，著色較深(見圖1B)。對照組大鼠未見TGF-β1表達(見圖2A)；糖尿病腎病組大鼠集合管、遠端小管、近端小管細胞質TGF-β1表達明顯增強(見圖2B)。對照組大鼠集合管、遠端小管、近端小管細胞質表達少量CTGF，著色較淺(見圖3A)；糖尿病腎病組大鼠上述部位CTGF表明顯增強，著色較深(圖3B)。

注：A為對照組，B為糖尿病腎病組

圖1　兩組大鼠腎組織MCP-1的表達(免疫組織化學法，×400)

表2　兩組大鼠24 h尿蛋白定量和血糖比較

注：▲為F值

注：A為對照組，B為糖尿病腎病組

圖2兩組大鼠腎組織TGF-β1的表達(免疫組織化學法，×400)

Figure2Expression of TGF-β1in renal tissue of the two groups

注：A為對照組，B為糖尿病腎病組

圖3兩組大鼠腎組織CTGF的表達(免疫組織化學法，×400)

Figure3Expression of CTGF in renal tissue of the two groups

2.4半定量分析兩組大鼠腎組織MCP-1、TGF-β1、CTGF平均吸光度比較，差異均有統計學意義(P<0.05，見表3)。

Table3Comparison of mean absorbance of MCP-1，TGF-β1and CTGF in renal tissue between the two groups

組別只數MCP-1TGF-β1CTGF對照組14021±002017±001016±002糖尿病腎病組18029±004020±002020±002t值-5017-4963-3649P值　0000　0000　0003

注：MCP-1=單核細胞趨化蛋白-1，TGF-β1=轉化生長因子β1，CTGF=結締組織生長因子

3　討論

糖尿病是一種全球性疾病，其發病率呈現顯著上升趨勢[7-8]，中國已經成為全球糖尿病第一大國[1]。糖尿病是一種嚴重的慢性、進展性疾病，嚴重地危害著人類的健康。糖尿病腎病已成為終末期腎病的主要原因，中國人群終末期腎病發生率高[8-9]。糖尿病腎病的發病機制比較復雜，近幾年炎癥學說備受關注，已經證明糖基化作用、生長因子/細胞因子、血流動力學改變等均參與糖尿病腎病的發病[10-12]，有學者提出把糖尿病腎病看作是一種由代謝和免疫聯系起來的炎癥性疾病。細胞因子MCP-1、TGF-β1、CTGF與人類很多疾病的發生有關，特別是免疫相關性疾病，但有關其在腎臟組織中表達部位及強度的研究報道較少。

單核細胞趨化蛋白(MCPs)是一系列結構相似、具有趨化功能的細胞因子，屬于趨化因子的CC亞族(β亞族)。MCP-1是CC亞族趨化性細胞因子中的重要成員。單核-巨噬細胞、成纖維細胞、腎小管上皮細胞均能產生和分泌MCP-1，MCP-1能夠吸附、趨化單核細胞而對中性粒細胞無作用[13]，同時可活化并促使腎小球上皮細胞、血管平滑肌細胞產生炎性因子，進一步放大腎間質炎癥反應[14]。MCP-1與CCR2在炎癥反應、新生血管生成、損傷修復中均有重要作用，MCP-1對CCR2的高親和力可用于檢測亞急性和慢性炎癥損害[13-15]。

TGF-β1首次于1972年被報道，目前報道有6種TGF-β分子，其中TGF-β1是目前研究最多的與疾病相關的分子，其具有廣泛的功能，在腫瘤[16]、臟器纖維化、創傷修復、炎癥性疾病及自身免疫性疾病[17]等的發生中具有重要意義，是重要的介導細胞對組織損傷的強效的致纖維化因子。在病理情況下，TGF-β1通過其免疫抑制機制，損傷機體的免疫監督機制，使機體失去對自我抗原、外來抗原的正常免疫應答，從而導致疾病的發生[18-20]。研究表明，TGF-β1可以誘導腎小管上皮細胞的自我吞噬并促進腎小管上皮細胞的凋亡，進而引起腎小管損傷[21-22]。

CTGF是一種富含半胱氨酸的分泌性多肽，是CCN家族成員之一，可能是TGF-β1下游信號遞質，能刺激細胞增殖和細胞外基質的形成，并在組織纖維化中起重要作用[23-24]。

本研究采用STZ誘發2型糖尿病腎病大鼠模型，造模成功后處死大鼠，解剖大鼠進行腎臟病理學染色，并用免疫組織化學的方法檢測其腎組織中MCP-1、TGF-β1、CTGF的表達。在光鏡下可觀察到3種因子在糖尿病腎病組大鼠的腎小管上皮細胞的胞質中均有較強的表達，腎小球內無表達，而對照組無表達或有極少量的表達，與文獻報道一致[25]。分析其原因可能與這3個細胞因子主要的功能是參與腎臟的纖維化、腎臟間質較腎小球易出現纖維化有關，但本研究觀察時間較短，大鼠模型尚屬糖尿病腎病早期，典型的腎臟病理改變即K-W結節未觀察到。用Image-Pro Plus Version 6.0彩色圖像分析處理軟件對腎組織中MCP-1、TGF-β1、CTGF的表達進行圖像半定量分析，結果顯示，糖尿病腎病組大鼠MCP-1、TGF-β1、CTGF平均吸光度均高于對照組，提示MCP-1、TGF-β1、CTGF參與了糖尿病腎病的發病過程。在2型糖尿病腎病的早期，腎臟中存在著細胞因子的參與，腎組織纖維化細胞因子表達增強，早期糖尿病腎病腎組織中就存在纖維化。筆者進行的前期實驗結果顯示：在光鏡下(HE染色、Masson染色、PAS染色)對照組大鼠腎組織結構正常，毛細血管袢開放良好，基底膜無增厚，系膜基質無增多；糖尿病腎病組大鼠可見腎小球系膜細胞增生，腎小球基膜增厚，足細胞增生，間質有炎性細胞浸潤、間質纖維化嚴重，腎小球系膜區PAS陽性物質沉積，呈不均勻的紅染；Masson染色腎小管內可見顆粒沉積及空泡變性，腎間質增多；而經環磷酰胺治療的大鼠病理改變明顯減輕[3]。

綜上所述，細胞因子及炎性因子參與了2型糖尿病腎病的發病，糖尿病腎病早期就存在著纖維化改變，為今后采用免疫抑制劑治療2型糖尿病腎病提供了線索和依據，而細胞毒類藥物如環磷酰胺等能夠降低2型糖尿病腎病的蛋白尿、腎功能損害及病理改變。但由于本研究觀察時間較短，典型的K-W結節未能觀察到，仍需在今后的研究中進一步延長觀察時間，深入探討各種細胞因子在2型糖尿病腎病不同階段的表達情況。

1薄虹，黃頌敏，吳蔚華，等.糖尿病腎病的現狀及對策[J].中華腎臟病雜志，2011，27(6)：464-465.

2馬青云.糖尿病腎病遺傳學研究現狀[J].中華糖尿病雜志，2012，4(1)：7-8.

3張亞莉，姜莎莎，李燕，等.CTX對2型糖尿病腎病的治療作用[J].山西醫科大學學報，2012，43(8)：571-575，636-637.

4李玉山，劉麗秋.實驗性2型糖尿病腎病大鼠模型研究[J].中國實驗診斷學，2009，13(5)：574-577.

5羅志峰，牟嬌，齊偉，等.4-苯基丁酸對糖尿病腎病大鼠的作用[J].中華腎臟病雜志，2012，26(5)：358-362.

6Tesch GH，Allen TJ.Rodent models of streptozotocin induced diabetic nephropathy[J].Nephrology(Carlton)，2007，12(3)：261-266.

7胡承，虞偉慧，賈偉平.中國人2型糖尿病遺傳學研究的現狀—兼談中西方人群差異[J].中華糖尿病雜志，2012，4(1)：4-6.

8張路霞，王海燕.從流行病學的角度探討我國糖尿病腎病的發病趨勢及對策[J].中華內科雜志，2010，49(9)：804-805.

9呂慶國，童南偉.糖尿病重要臨床進展回顧[J].中華內分泌代謝雜志，2012，28(4)：271-275.

10劉艷春，劉佳.糖尿病腎病的發病機制及治療[J].國際內分泌代謝雜志，2011，31(2)：84-86.

11Yeo ES，Hwang JY，Park JE，et al.Tumor necrosis factor(TNF-α)and C-reactive protein(CRP)are positively associated with the risk of chronic kidney disease with type 2 diabetes[J].Yonsei Med J，2010，51(4)：519-525.

12劉海霞，劉奔，劉丹丹，等.慢性炎癥標志物檢測對于2型糖尿病早期腎臟病診斷的臨床意義[J].中國糖尿病雜志，2012，20(2)：108-110.

13鮑榮輝，劉先哲.單核細胞趨化蛋白研究進展[J].醫學研究雜志，2006，35(4)：58-60.

14Luther SA，Cyster JG.Chemokines as regulators of T cell differentiation[J].Nat Immunol，2001，2(2)：102-107.

15楊立明，許丹，馬威，等.急性冠脈綜合征患者血漿單核細胞趨化因子-1水平的相關研究[J].中國全科醫學，2010，13(3)：925.

16馬洪波，黃濤，韓風,等.轉化生長因子β1和Smad4蛋白在肝癌組織中的表達及其意義[J].中國全科醫學，2012，15(8)：2780.

17閆慧明，丁利芳，劉媛，等.轉化生長因子-β1與結締組織生長因子在類風濕關節炎合并肺間質病變患者血清中的表達水平及臨床意義[J].中國全科醫學，2012，15(10)：3268.

18高春芳.TGFβ1基因變異與疾病相關性研究進展[J].世界華人消化雜志，2007，15(28)：2961-2965.

19Qi MY，Kai-Chen，Liu HR，et al.Protective effect of lcariin on the early stage of experimental diabetic nephropathy induced by streptozotocin via modulating transforming growth factor β1and type Ⅳ collagen expression in rats[J].J Ethnopharmacol，2011，138(3)：731-736.

20馬洪亮，王英，付建峰,等.先天性心臟病伴肺動脈高壓患兒血清中血管內皮生長因子與轉化生長因子-b1的變化研究[J].疑難病雜志，2011，10(2)：89.

21Xu Y，Yang S，Huang J，et al.Tgf-β1induces autophagy and promotes apoptosis in renal tubular epithelial cells[J].Int Mol Med，2012，29(5)：781-790.

22陳娟娟.血清轉化生長因子-β1和層黏連蛋白在2型糖尿病腎病早期診斷中的應用價值[J].中國全科醫學，2010，13(6)：1989.

23李勤操，鄭喜邦，王曉輝，等.結締組織生長因子小干擾RNA的構建及其干擾效果的檢測[J].生物技術通訊，2008，19(3)：347-349.

24趙慧娟，李曉東，孫東立，等.原發性腎小球腎炎患者尿中結締組織生長因子的檢測及其臨床意義[J].中國全科醫學，2010，13(4)：1079.

25馬麗娟，杜國利，呂文魁，等.氯沙坦鉀對 2型糖尿病腎病大鼠腎臟TGF-β1、CD68和MCP-1表達的影響[J].中國病理生理雜志，2012，28(5)：947-950.