橋本甲狀腺炎患者外周血單個核細胞程序性死亡因子5的表達及其意義

趙 杰，趙麗娜，趙 靜，張秀軍

橋本甲狀腺炎(Hashimoto′s thyroiditis，HT)是一種器官特異性自身免疫性疾病，以對甲狀腺抗原的免疫應答和甲狀腺腺體內的淋巴細胞浸潤為特征，其發病機制涉及細胞免疫和體液免疫的異常。近年來人們逐漸認識到細胞凋亡在HT的發病機制中起著重要的作用。程序性死亡因子5(programmed cell death 5，PDCD5)是一種重要的凋亡調控分子，研究發現PDCD5在凋亡相關疾病如惡性腫瘤及自身免疫性疾病的發病過程中起重要的作用。有研究證實，HT患者甲狀腺細胞中PDCD5呈陽性表達[1]。本研究采用半定量逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)方法測定了60例HT患者外周血單個核細胞(peripheral blood monouclear cell，PBMC)PDCD5 mRNA的表達情況，探討PDCD5與HT發生發展的關系。

1　資料與方法

1.1一般資料選取華北煤炭醫學院附屬醫院2006年3—8月內分泌門診或住院HT患者60例(HT組)，其中男8例，女52例；平均年齡(40.2±14.5)歲。根據臨床表現、甲狀腺功能檢測結果、甲狀腺核素掃描結果等臨床診斷為HT。所選患者均為尚未給予治療的初診患者，且無其他自身免疫性疾病、腫瘤及其他內分泌疾病史。根據患者外周血血清中抗甲狀腺微粒體抗體(TMAb)水平，將其分為HT1 組(TMAb≤45%)36例和HT2組(TMAb>45%)24例。另選取同期在我院體檢的健康者40例(對照組)，其中男5例，女35例；平均年齡(38.1±11.3)歲；均與HT組患者的性別構成、年齡匹配。

1.2主要試劑淋巴細胞分離液(中國醫學科學院血液學研究所)；總RNA提取試劑Trizol(北京天為時代科技有限公司)；莫洛尼鼠白血病病毒反轉錄酶逆轉錄試劑盒(Promega Corporation)；2×Taq PCR MasterMix(北京天為時代科技有限公司)；dNTP、Ribonuclease Inhibitor、DL2000(寶生物工程有限公司)。

1.3方法

1.3.1淋巴細胞的分離取HT組和對照組肝素抗凝外周血5 ml，按常規Ficoll密度梯度離心分離PBMC。

1.3.2半定量RT-PCR方法檢測PDCD5基因的表達

1.3.2.1總RNA提取細胞總RNA的提取按Trizol RNA總提取試劑盒說明書進行。反應結束后，取適量的RNA進行紫外線定量(OD260/OD280)和1%瓊脂糖凝膠電泳，鑒定其完整性，余者在-70 ℃保存。

1.3.2.2cDNA合成以獲得的細胞總RNA為模板，使用MML-V逆轉錄試劑盒逆轉錄合成cDNA，采用25 μl反應體系。逆轉錄條件：37 ℃水浴1 h，72 ℃水浴10 min，-20 ℃保存。

1.3.2.3引物設計與合成利用Primer Premier 5.0設計PDCD5基因引物序列，上游引物：5′-CAA CAG GAA GCA AAG CAC-3′，下游引物：5′-GAT CTT AAC TTC TGT CCT AGA C-3′，PCR擴增片段長度384 bp。內參照β-actin引物序列，下游引物：5′-CCC AGG CAC CAG GGC GTG ATG GT-3′，上游引物：5′-GGA CTC CAT GCC CAG GAA GGA A-3′，PCR擴增片段長度701 bp。引物均由上海生工生物工程有限公司合成，聚丙烯酰胺凝膠電泳法純化。

1.3.2.4PCR擴增取2 μl cDNA，分別加入10 pmol特異性PDCD5(或β-actin)上游和下游引物，12.5 μl 2×Taq PCR Master Mix和8.5 μl 雙蒸水，反應體系為25 μl。經優化的PCR反應條件為：預變性94 ℃ 3 min，然后94 ℃變性40 s，61 ℃退火45 s，72 ℃延伸50 s，共35個循環；最后72 ℃延伸5 min結束反應。

PCR擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，BIO-RAD-GD2000凝膠成像系統照相記錄試驗結果，Quantity one軟件分析條帶灰度值。384 bp和701 bp均有條帶顯示時記作PDCD5 mRNA表達陽性，計算PDCD5與β-actin RT-PCR產物吸光度比值(RI值)，將RI值作為PDCD5 mRNA的相對含量。比較對照組和HT組PBMC PDCD5 mRNA表達陽性率及其相對含量。然后比較HT1組和HT2組患者甲狀腺功能〔總三碘甲狀腺原氨酸(TT3)、總甲狀腺素(TT4)、游離三碘甲狀腺原氨酸(FT3)、游離甲狀腺素(FT4)〕、血清甲狀腺球蛋白抗體(TGAb)水平及PBMC PDCD5 mRNA表達水平。

2　結果

2.1序列測定PDCD5基因PCR擴增產物進行雙向序列測定，經與Gene Bank對比，同源性均為100%，證實PCR產物的正確性。

2.2對照組和HT組PBMC PDCD5基因的表達對照組中，24例(60.0%)健康者PBMC PDCD5 mRNA表達陽性，相對表達水平為(0.38±0.08)。HT組中，52例(86.7%)患者PBMC PDCD5 mRNA表達陽性，相對表達水平為(0.87±0.19)。HT組患者PDCD5 mRNA表達陽性率、相對表達水平與對照組比較，差異均有統計學意義(χ2=9.355，P<0.01；t=4.870，P<0.01，見圖1)。

2.3HT1組和HT2組患者甲狀腺功能、血清TGAb水平及PDCD5 mRNA表達水平比較兩組患者血清TT3、TT4、FT3、FT4水平比較，差異均無統計學意義(P>0.05)；而兩組患者甲狀腺球蛋白抗體(TGAb)水平及PBMC PDCD5 mRNA表達水平比較，差異均有統計學意義(P<0.01，見表1、圖1)。

3　討論

PDCD5基因是由北京大學人類疾病基因研究中心從人的白血病細胞株TF-1中克隆得到的新基因，該基因定位于染色體19q12-q13.1，由6個外顯子和5個內含子組成，在人類50余種組織中均有表達。PDCD5具有促進多種細胞凋亡和抑制增殖的效應，不僅在細胞凋亡時表達增加，而且凋亡早期就出現明顯的核轉位現象[2]。該因子可與Caspase-3特異性結合，提高Caspase-3蛋白的活性[3]。單獨存在時不具備誘導凋亡的作用，但與其他凋亡誘導劑同時存在時則可明顯促進凋亡進程。

HT是一種常見的自身免疫性甲狀腺病(AITD)，免疫損傷主要累及甲狀腺，最終導致甲狀腺濾泡破壞和甲狀腺功能減退癥，其發病機制尚未完全清楚。最近的研究發現甲狀腺細胞凋亡的調控異常是導致HT發病的主要原因之一[ 4-6]。HT甲狀腺細胞表達Fas/ FasL[7]，且其表達量與甲狀腺細胞和浸潤淋巴細胞之間的距離呈反比[8]，提示Fas/FasL凋亡通路在HT發病中起重要作用。Hammond等[9]采用流式細胞術檢測了1例正常者、4例HT患者、8例Graves病(GD)患者甲狀腺細胞Fas的表達，結果顯示GD患者和HT患者甲狀腺細胞凋亡率明顯高于正常者，其中尤以HT患者甲狀腺細胞凋亡率最高。

注： 1、2為HT1組，3、4、9、10為HT2組，5、6、7、8為對照組，M為DNA marker

圖1半定量RT-PCR方法檢測 PDCD5 mRNA表達水平的電泳圖

Figure1PDCD5 mRNA expression in PBMC of patients with HT by RT-PCR

表1　HT1組和HT2組患者甲狀腺功能、TGAb水平及PDCD5 mRNA表達水平比較

注： TT3=總三碘甲狀腺原氨酸，TT4=總甲狀腺素,FT3=游離三碘甲狀腺原氨酸，FT4=游離甲狀腺素，TGAb=甲狀腺球蛋白抗體，PDCD5=程序性死亡因子5

細胞凋亡在維持組織的自身平衡、控制異常細胞的生長以及調節免疫反應中起重要作用，是限制外周循環中自身反應性T細胞過度增殖的重要方式。破壞細胞凋亡平衡將會引起自身免疫的紊亂，引發自身免疫性疾病。HT外周血淋巴細胞凋亡的機制復雜，涉及多種凋亡相關因子，因此報道較少。Maruoka等[10]認為，病情嚴重的自身免疫性甲狀腺病患者外周T淋巴細胞Fas表達增高。已報道PDCD5在正常甲狀腺濾泡細胞中幾乎未見表達，在HT甲狀腺濾泡細胞中呈陽性表達，PDCD5參與了HT的發病過程[1]。本研究結果顯示，HT患者和健康者PBMC PDCD5 mRNA表達的陽性率分別為86.7%和60.0%，提示PDCD5在健康者和HT患者的PBMC中普遍表達，PDCD5可能是對PBMC(以淋巴細胞為主)的凋亡有重要作用的管家基因。另外，本研究中HT患者PDCD5 mRNA表達陽性率和相對表達水平均高于健康者，提示PDCD5可能是繼Fas、Bcl-2、TRAIL[8]等經典凋亡途徑之后又一新的影響HT免疫細胞凋亡平衡的因子。

HT可產生多種自身抗體并且發生一系列反映甲狀腺功能的血清激素水平的改變。HT的發病是一個慢性過程，發病初期比較隱匿，早期表現為類似于甲狀腺功能亢進的癥狀，表現為TT3、TT4水平升高，促甲狀腺激素(TSH)水平降低，后期隨著病情的發展才表現為甲狀腺功能減退癥狀。HT時TMAb、TGAb升高，TMAb、TGAb是反映HT病情和病情進展情況的最主要的指標。本研究進一步根據血清TMAb水平，將HT患者分為HT1組和HT2組，發現HT2組患者TGAb水平及PDCD5 mRNA表達水平高于HT1組。提示隨著血清TMAb水平的升高，HT患者血清TGAb水平和PBMC PDCD5 mRNA的相對表達水平都相應升高。本研究選擇未經治療的初診HT患者，隨病情加重PDCD5表達增加，與其甲狀腺上皮細胞損傷的病理特征相符，推測細胞凋亡可能是導致其甲狀腺功能減退的原因之一。PBMC PDCD5 mRNA的表達水平能夠在一定程度上反映HT的病情進展情況。

綜上所述，HT患者PBMC PDCD5 mRNA的表達上調，而且隨著病情的加重PDCD5的表達增加，提示PDCD5可能作為淋巴細胞凋亡的正調控因子在HT的發生和發展過程中具有重要意義。但是疾病發生過程是多種凋亡調控基因共同作用的結果，關于PDCD5如何影響HT凋亡平衡的具體機制還有待于進一步研究。

1王海寧，杜穎，洪天配.TF-1細胞凋亡相關基因19在橋本病甲狀腺細胞中的表達[J].中華內分泌代謝雜志，2004，20(2)：119-120.

2Chen YY，Sun RH，Han WL，et al.Nuclear translocation of TFAR19(PDCD5)：an early signal for apoptosis[J].FEBS letter，2001，509(27)：191-196.

3Liu H，Wang Y，Zhang Y，et al.TFAR19，a novel apoptosis-related gene cloned from human leukemia cell line TF-1，could enhance apoptosis of some tumor cells induced of growth factor withdrawal [J].Biochem Biophys Res Commun，1999，254(1)：203-210.

4Andrikoula M，Vatholomatos G，Tsangaris GT，et al.Fas and Bcl-2 protein expression in thyrocytes of patient with nodular goiter[J].European Journal of Endocrinology，2001，145(4)：403-407.

5Salmaso C，Bagnasco M.Regulation of apoptosis in endocrine autoimmunity：insights from Hashimoto′s thyroiditis and Graves′ disease[J].Ann N Y Acad Sci，2002，966(6)：496-501.

6Chen S，Fazle Akbar SM.Analysis of the expression of Fas，Fast and Bcl-2 in the pathogenesis of autoimmune thyroid disorders[J].Cell Mol Immunol，2004，1(3)：224-228.

7劉建夏，秦磊，左劍玲，等.Fas/FasL介導的凋亡在橋本病發病機制中的作用[J].中華內分泌代謝雜志，2003，19(2) ：107-108.

8Stokes TA，Rymaszeuski M，Arscott PL，et al.Constitutive expression of FasL in thyrocytes[J].Science，1998，279(5359)：2015.

9Hammond LJ，Lowdell MW，Cerrano PG，et al.Analysis of apoptosis in relation to tissue destruction associated with Hashimoto′s autoimmune thyroiditis[J].J Pathol，1997，182(2)：138-144.

10Maruoka H，Watanaba M，Matsuzuka F，et al.Increased intensities of fas expression on peripheral T-cell subsets in severe autoimmune thyroid disease[J].Thyroid，2004，14(6)：417-423.