同型半胱氨酸及其代謝酶亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態性在傣族高血壓及正常人群的分布研究

張 蕾，孫 浩

高血壓在我國已經成為嚴重威脅人們健康的主要疾病，亦是導致腦血管疾病的重要危險因素。近年研究表明，同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)水平升高可以造成血管內皮損傷、血管平滑肌增生,并抑制一氧化氮(NO)合酶和前列環素 (PGI2)的合成,這些損害目前被認為與高血壓的發病有關。亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)對Hcy水平有重要影響,其基因C677T突變可影響該酶的活性,使Hcy代謝異常。但MTHFR基因C677T多態性與Hcy水平改變對高血壓發病的影響國外報道不一,國內報道亦未涉及少數民族人群。本研究對傣族高血壓患者及健康者血清Hcy水平與MTHFR基因C677T多態性進行檢測,以探討MTHFR基因C677T多態性、Hcy水平改變與傣族人群高血壓發病的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2011年3月在西雙版納傣族自治州進行疾病普查時選取傣族高血壓患者133例，其中男76例，女57例；年齡29～81歲，平均60.5歲。不同時間在靜息狀態下測量血壓，3次均≥140/90 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)(分次測量血壓的時間間隔不小于5 min)為高血壓。傣族健康者134例，其中男71例，女63例；年齡23～79歲，平均58.5歲。排除患有冠心病、周圍血管病、血液系統疾病、肝腎功能異常、甲狀腺疾病、嚴重感染、惡性腫瘤、糖尿病、慢性胃腸道疾病、妊娠，近2周內服用過甲氨蝶呤、NO、避孕藥、抗癲癇藥、葉酸、B族維生素、雌激素、異煙肼、酰胺咪嗪、煙酸、肼苯噠嗪者。

1.2 MTHFR分型方法 以聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)技術檢測MTHFR基因C677T(rs1801133)突變情況。取250 μl外周血，使用AxyPrep血基因組DNA小量制備試劑盒(AxyGen中國)提取白細胞中的DNA。使用引物F:5′-GGAAGGTGCAAGATCAGAGC-3′和R:5′-CTGGGAAGAACTCAGCGAAC-3′對rs1801133進行擴增。擴增條件為(PCR試劑來自TaKaRa公司)：DNA樣本20 ng,MgCl2(25 mmol/L)：1.2 μl；dNTP(2.5 mmol/L)：1.6 μl；正反向引物(5 μmol/L)各1 μl；Taq酶(55 U/μl)：0.16 μl；10×PCR Buffer：2.5 μl；加水至總體積20 μl。擴增條件為：94 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，至第一步重復30個循環，72 ℃ 10 min。

取PCR產物5 μl，酶切緩沖液2 μl，Hinf Ⅰ內切酶(1 U/μl)0.5 μl(TakaRa 中國)加水至20 μl，37 ℃酶切過夜，最后用2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定結果。

經過PCR擴增，擴增片段長度428 bp，因為Hinf Ⅰ內切酶在此片段上有兩個酶切位點，因此無論C677T位點突變情況如何，首先此片段都會被切為34 bp和394 bp 2條。因此經Hinf Ⅰ酶切后，當C677T位點的基因型為TT時，產生3條帶：34 bp、165 bp和229 bp；當C677T位點基因型為CC時產生2條帶：34 bp和394 bp；當此位點為雜合(T/C)時產生4條帶：34 bp、165 bp、229 bp和394 bp。由于34 bp片段在電泳時不明顯，因此只能觀察到其他條帶，但已經能進行基因分型(見圖1)。

1.3 血清Hcy水平測定 受檢者空腹12 h以上，清晨抽取靜脈血3 ml置于真空未抗凝試管中，在1 h內分離血清，剔除溶血、脂血、黃疸標本，嚴格按儀器操作程序進行檢測，檢測前用試劑配套定標樣品進行定標，標本均在2 h內檢測完畢。儀器使用日立7600-01大型全自動生化分析儀，由四川邁克生物科技股份有限公司提供Hcy檢測試劑盒，采用循環酶法測定Hcy水平。

2 結果

2.1 一般資料 兩組患者性別及Hcy水平比較，差異均無統計學意義(P>0.05)；高血壓組患者年齡、收縮壓、舒張壓較健康組升高，差異均有統計學意義(P<0.05，見表1)。

注：M：marker；1：TT等位基因型可見2條帶165 bp和229 bp；2：CT等位基因型可見3條帶165 bp、229 bp和394 bp；3：CC等位基因型可見1條帶394 bp (34 bp片段太小電泳不可見)

圖1 C677T經過PCR擴增片段Hinf Ⅰ酶切后電泳結果

Figure1 Electropherogram of C667T cut by PCR amplification fragment Hinf Ⅰ enzyme

表1 兩組一般資料比較

注：*為χ2值，余檢驗統計量值為t值；Hcy=同型半胱氨酸

2.2 C677T等位基因頻率分布 高血壓組與健康組C677T等位基因頻率分布比較，差異無統計學意義(χ2=0.32，P=0.57，見表2)。

2.3 C677T突變與Hcy水平相關性 顯性模式和隱形模式不同基因型者Hcy水平比較，差異均無統計學意義(P>0.05，見表3)。

表2 高血壓組與健康組C677T等位基因頻率分布〔n(%)〕

Table2 Distribution of allele frequency of C677T in MTHFR in health adults and hypertension patients

組別等位基因數CT高血壓組266204(76.7)62(23.3)健康組268211(78.7)57(21.3)

表3 C677T突變與Hcy水平相關性

3 討論

Hcy又稱高半胱氨酸，于1931年由Vincent du Vigneaud首次從膀胱結石中分離得到，它是一種含硫的氨基酸，不屬于組成蛋白質的20種氨基酸，本身不參與蛋白質的合成，也沒有特異的3個DNA堿基對其進行編碼，體內不能合成，它是蛋氨酸和半胱氨酸代謝過程中重要的中間產物，只能來源于蛋氨酸(甲硫氨酸)的分解代謝。Hcy主要通過再甲基化和轉硫基途徑代謝。MTHFR、蛋氨酸合成酶(MS)、胱硫醚β合成酶(CBS)是Hcy代謝過程中的關鍵酶[1]。Hcy代謝酶的基因多態性可以影響酶的活性而影響血漿Hcy水平[2]。人類MTHFR基因定位于染色體1p36.3，全長1 980 bp，已發現具有高度多態性。該酶基因的C677T不耐熱突變是產生輕中度高Hcy最常見的一個遺傳決定因素[1]。在中國人中，腦卒中患者MTHFR基因純合子突變和雜合子突變的發生率顯著高于正常人，而T等位基因頻率也明顯高于正常對照組，說明MTHFR基因可能是腦卒中的易患基因之一。但也有研究顯示MTHFR基因C677T突變是同型半胱氨酸血癥的成因之一，但并不直接導致腦梗死，且與病程發展無關[3]。

較多的報道表明，Hcy通過多種作用機制導致血壓升高[4-7]：(1)血中Hcy升高可以促進血管壁彈性纖維加速溶解，降低彈性纖維的含量，同時促進膠原纖維的合成，從而改變動脈壁彈性。(2)Hcy有促進平滑肌細胞增殖的作用，導致動脈壁的順應性下降。(3)血Hcy可以誘導血管內皮細胞凋亡，促進細胞內超氧化物的生成，使依賴于NO的血管舒張功能受限，引起血壓升高。(4)Hcy可以促進血管平滑肌細胞內鈣離子的聚集，造成血管的收縮。另外，較多資料顯示高血壓與血漿Hcy水平有顯著相關性[8-9]。

但是本研究表明，在傣族人群中，高血壓患者并沒有表現出較高的Hcy水平，與健康者之間沒有差異，其原因可能與種群差異、飲食習慣等有關系。體內Hcy水平與飲食有著密切的關系，血漿中維生素B6、B12和葉酸水平越低，Hcy水平越高。

是否因為基因原因導致傣族人群Hcy水平表達偏低，從而導致高血壓患者亦有較低的Hcy水平。本研究檢測了Hcy的代謝酶MTHFR基因C677T等位基因頻率，未發現兩組間的差異。這說明，在傣族人群可能還存在其他保護基因導致Hcy的低表達。這些因素包括基因的種間差異、飲食結構、環境等。進一步研究少數民族與漢族之間關鍵基因的種間差異，對于預防甚至治療腦血管疾病具有重要的現實意義。另外，由于本研究樣本偏少，還需要進行較大規模的普查研究以進一步證實研究結論以及進行更深入的研究。

1 林小慧，李娜，董玉娟.同型半胱氨酸及其代謝酶基因多態性與動脈粥樣硬化和腦梗死[J].國外醫學腦血管疾病分冊,2004,12(5):367-370.

2 岳紅，王迎，張華屏，等.同型半胱氨酸及其代謝酶基因多態性與腦梗死的關系[J].山西醫藥雜志，2010，39(2):108-111.

3 楊凌宇，余華峰，楊凌，等.Hcy、MTHFR基因多態性與急性腦梗死關系的臨床研究[J].中國康復理論與實踐，2009,15(2)：135-137.

4 Ralland PH,Friggi A,Barlatier A,et al.Hyperhomocysteinemia induced vascular damage in the minipig.C aptopril- hydrochlorothiazide combination prevents elastic alterations[J].Circulation,1995,91(4):1161-1174.

5 Buemi M,Marino D,Di Pasquale G,et al.Effects of homocysteine on proliferation,necrosis,and apoptosis of vascular smooth muscle cells in culture and influence of folic acid[J].Thromb Res,2001,104(3):207-213.

6 Faraci FM,Lentz SR.Hyperhomocysteinemia,oxidative stress,and cerebral vascular dysfunction[J].Stroke,2004,35(2):345-347.

7 Austin RC,Lentz SR,Werstuck GH.Role of hyperhomocysteinemia in endothelial dysfunction and atherothrombotic disease[J].Cell Death Differ,2004,11(1):S56-S64.

8 李觀華,張啟貴,劉曉峰，等.血清同型半胱氨酸與高血壓之間關系的研究[J].國際檢驗醫學雜志,2011,32(20):2411-2412.

9 Lim U,Cassano PA.Homocysteine and blood pressure in the Thrid National Health and Nutrition Examination Survey,1988-1994[J].Am J Epidemiol,2002,156(12):1105-1113.