胃癌及癌前病變中幽門螺桿菌感染與分泌型卷曲相關蛋白基因啟動子甲基化的關系研究

杜美林，王小玲，樊建平，張立瑋，內田智久，村上和成，王 續，劉月平，王士杰

胃癌是常見的惡性腫瘤之一，也是主要的表觀遺傳疾病，近年來學者對胃癌的表觀遺傳學關注度極高，表觀遺傳學包括基因甲基化、組蛋白修飾、微小RNA調控等[1]。其中基因甲基化備受關注，很多基因的甲基化與腫瘤發生有密切關系，是腫瘤發生的重要因素，并且關系著腫瘤的進展、治療及預后。隨著分子生物學技術的不斷發展，進一步研究信號傳導通路在胃癌發生發展中的作用，尋求抗腫瘤藥物治療的新靶點是腫瘤研究的新熱點，其中研究最多的是Wnt通路，分泌型卷曲相關蛋白(secreted frizzled-related proteins，SFRPs)在此通路中發揮了重要作用。正常情況下，SFRPs競爭性抑制Fz受體，使Wnt通路的轉錄激活信號封閉，從而使調控下游基因表達的β-連環蛋白處于穩定狀態；當SFRPs基因發生甲基化時，導致Wnt通路激活，細胞過度增殖，從而導致腫瘤發生[2]。大量研究已表明SFRPs的高甲基化可導致腫瘤發生，尤其在消化道腫瘤中高表達[3]。

此外，幽門螺桿菌(H.pylori)是已確認的胃癌Ⅰ類致癌原，這與H.pylori菌株不同、宿主基因易感性及環境因素有關。H.pylori本身不能導致腫瘤發生，但是其感染后的代謝產物及感染引起的炎性反應促使原癌基因相繼被激活，抑癌基因丟失或功能失活，出現基因表達異?；蚬δ馨l生改變，從而引起細胞增殖，導致腫瘤形成[4-5]。有研究顯示，在胃癌及癌前病變中H.pylori感染可能與異常DNA甲基化相關[6]。故根除H.pylori是否能逆轉基因甲基化？本研究探討了H.pylori感染致SFRPs基因啟動子甲基化的機制和相關性，以期為胃癌的治療提供新療法。

1 材料與方法

1.1 標本 隨機抽取河北醫科大學第四醫院2012年10—11月內鏡咬檢不同胃黏膜病變標本72例，其中胃癌40例，異型增生17例，慢性胃炎15例；中位年齡為43歲；男女比例為3.8∶1?；颊呔唇邮苓^任何治療，除胃病以外無其他疾病，并有完整的臨床病理資料及隨訪資料，且患者均為無親緣關系的河北省漢族人。

1.2 方法 每例患者均在胃組織同一部位取2塊標本，1塊于-20 ℃保存用于提取全基因組DNA，另1塊放入10%甲醛溶液中固定，留作病理組織學檢查及免疫組化檢測。

1.2.1 提取全基因組DNA 采用Ezup柱式動物基因組DNA抽提試劑盒提取標本的基因組DNA，選用亞硫酸氫鈉(NaHSO3)、對苯二酚、氫氧化鈉(NaOH)、蒸餾水的混合溶液進行DNA的修飾。然后采用Wizard?DNA Clean-Up System試劑盒，加入80%異丙醇2 ml、3 mol/L NaOH 2 ml、10 mol/L醋酸銨5 ml、pH 8.3 Tris-HCl緩沖鹽溶液(TBS)、70%乙醇，按步驟進行DNA純化。

1.2.2 甲基化特異性聚合酶鏈反應(MSP) 由于引物序列的特異性，會出現兩種情況：一是甲基化特異引物(M)擴增出目的條帶，而非甲基化特異引物(U)無條帶擴出，這種情況為甲基化；二是U擴增出目的條帶，而M無條帶擴出，這種情況為非甲基化。本研究的引物均由上海生工生物工程技術公司合成，包含SFRPs的甲基化與非甲基化位點的基因片段。擴增片段長度分別為SFRP1：M 113 bp、U 112 bp；SFRP2：M 153 bp、U 163 bp；SFRP4：M 155 bp、U 163 bp；SFRP5：M 113 bp、U 119 bp。

MSP的反應體系為：10×MSP Buffer 2 μl、25 mmol/L氯化鎂(MgCl2)1.2 μl、2 mmol/L dNTP 1 μl、50 μmol/L primer1 1 μl、50 μmol/L primer2 1 μl、5 U/μl Taq酶0.5 μl、NaHSO3修飾過的DNA 2.5 μl、H2O 2.3 μl，總體積為20 μl。MSP擴增之后的產物經過瓊脂糖凝膠電泳，后于紫外凝膠成像系統觀察、拍照并保存。以DNA Marker作為對照，觀測長度為各自堿基數目的擴增片段。

如果在含有上游引物SFRP1的反應體系中出現113 bp擴增片段的標本，表明是SFRP1甲基化基因片段，112 bp是SFRP1非甲基化基因片段(見圖1)；在含上游引物SFRP2的反應體系中出現153 bp擴增片段的標本，表明是SFRP2甲基化基因片段，163 bp是SFRP2非甲基化基因片段(見圖2)；在含有上游引物SFRP4的反應體系中出現155 bp的擴增片段的標本，表明是SFRP4甲基化的基因片段，163 bp是SFRP4非甲基化基因片段(見圖3)；在含有上游引物SFRP5的反應體系出現113 bp的擴增片段的標本，表明是SFRP5的甲基化基因片段，119 bp是SFRP5非甲基化基因片段(見圖4)。

1.2.3 免疫組化法(SP法)檢測胃黏膜組織H.pylori的表達 內鏡下取胃黏膜活檢組織快速固定于10%甲醛溶液中，24 h后取出，然后在常溫下梯度脫水、透明、浸蠟、包埋，蠟塊常溫保存。按照SP法的步驟將保存好的蠟塊進行切片，并進行抗原修復，滴加二抗(快捷型酶標羊抗鼠/兔IgG聚合物)，磷酸鹽緩沖液(PBS)進行沖洗，室溫孵育，最后滴加顯色劑進行顯色，鏡下觀察H.pylori的感染情況。

注：m為DNA Marker(500、400、300、200、150、100、75、50 bp)，M為甲基化的SFRP1基因，U為非甲基化的SFRP1基因；1～2為胃癌組，3為異型增生組，4為慢性胃炎組

圖1 SFRP1基因電泳圖

Figure1 Electrophoresis of SFRP1 gene

注：m為DNA Marker(500、400、300、200、150、100、75、50 bp)，M為甲基化的SFRP2基因，U為非甲基化的SFRP2基因；1～2為胃癌組，3為異型增生組，4為慢性胃炎組

圖2 SFRP2基因電泳圖

Figure2 Electrophoresis of SFRP2 gene

注：m為DNA Marker(500、400、300、200、150、100、75、50 bp)，M為甲基化的SFRP4基因，U為非甲基化的SFRP4基因；1～2為胃癌組，3為異型增生組，4為慢性胃炎組

圖3 SFRP4基因電泳圖

Figure3 Electrophoresis of SFRP4 gene

注：m為DNA Marker(500、400、300、200、150、100、75、50 bp)，M為甲基化的SFRP5基因，U為非甲基化的SFRP5基因；1～2為胃癌組，3為異型增生組，4為慢性胃炎組

圖4 SFRP5基因電泳圖

Figure4 Electrophoresis of SFRP5 gene

1.3 統計學方法 采用SPSS 13.3軟件進行統計檢驗。計數資料比較采用χ2檢驗。H.pylori感染與SFRPs基因啟動子甲基化之間的關系采用Spearman等級相關分析。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 不同胃黏膜病變組織SFRPs基因啟動子甲基化狀態 72例標本中，測得SFRP1、SFRP2、SFRP4、SFRP5基因啟動子甲基化分別為34例(47.2%)、36例(50.0%)、27例(37.5%)和30例(41.7%)。不同胃黏膜病變組SFRP1、SFRP2、SFRP4、SFRP5基因啟動子甲基化率比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；慢性胃炎組、異型增生組、胃癌組SFRP1、SFRP2、SFRP4、SFRP5基因啟動子甲基化率依次增加，兩兩比較差異均有統計學意義(P<0.05，見表1)。

表1 不同胃黏膜病變組織中SFRPs基因啟動子甲基化率比較〔n(%)〕

Table1 Comparison of methylation rate of SFRPs gene in the tissues of different gastric mucosal lesions

組別例數SFRP1SFRP2SFRP4SFRP5慢性胃炎組150000異型增生組17 5(29.4)* 6(35.3)* 2(11.8)* 4(23.5)* 胃癌組4029(72.5)*△30(75.0)*△25(62.5)*△26(65.0)*△χ2值28.42529.25826.20524.011P值 0.000 0.000 0.000 0.000

注：SFRP=分泌型卷曲相關蛋白；與慢性胃炎組比較，*P<0.05；與異型增生組比較，△P<0.05

2.2 不同胃黏膜病變組織H.pylori感染率比較 72例標本中，22例(30.6%)感染H.pylori；不同胃黏膜病變組織H.pylori感染率比較，差異有統計學意義(P<0.05)；胃癌組、慢性胃炎組、異型增生組胃黏膜H.pylori感染率依次增加，兩兩比較差異均有統計學意義(P<0.05，見表2)。

表2 不同胃黏膜病變組織中H.pylori感染率比較〔n(%)〕

Table2 Comparison of H.pylori infection rate in different gastric mucosa lesions

組別例數H.pylori+ -慢性胃炎組15 5(33.3) 10(66.7)異型增生組1713(76.5)* 4(23.5) 胃癌組40 4(10.0)*△ 36(90.0)χ2值24.120P值 0.000

注：與慢性胃炎組比較，*P<0.05；與異型增生組比較，△P<0.05

2.3 H.pylori感染與SFRPs基因啟動子甲基化的相關性 Spearman等級相關分析結果顯示，H.pylori感染與SFRPs基因啟動子甲基化間無線性相關(rs=0.264，P<0.05)。

3 討論

我國胃癌的特點是：(1)發病率高，我國每年新增胃癌病例約40萬；(2)早期診斷率小于10%；(3)手術切除率低，總的胃癌手術切除率為50%～70%；(4)5年生存率低，我國胃癌根治術后5年生存率為32%～40%。近年來研究表明腫瘤的發生發展是基因組學和表觀遺傳學共同作用的結果。表觀遺傳是指DNA序列不發生變化，但基因表達卻發生了可遺傳的改變[7]，表觀遺傳修飾包括DNA甲基化、組蛋白修飾、microRNA、染色質重塑等。DNA甲基化是主要的表觀遺傳學修飾方式，是指在DNA甲基轉移酶的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體，將甲基轉移到胞嘧啶上[8]。哺乳動物基因組DNA甲基化主要位點是CpG島，據統計，大于50%的基因啟動子區含有CpG島。啟動子區的CpG島通常處于非甲基化狀態，使基因得以正常表達；當其發生甲基化時，會影響基因的轉錄調控，使基因表達發生沉默。

胃癌是一種表觀遺傳學疾病，DNA甲基化作為一種主要的表觀遺傳學修飾方式，在胃癌的發生發展中起到了重要作用。Wnt通路中的Wnt蛋白是一種分泌型糖蛋白家族，通過與細胞表面機制及特異性Fz受體結合激活下游信號傳導途徑，在細胞轉運、生物發育、腫瘤形成、細胞凋亡等過程中發揮了重要的作用，其異?；罨c腫瘤的發生、發展密切相關[9]。多種消化道腫瘤存在Wnt信號通路異常激活。在此通路中，最經典的是Wnt-β-catenin-TCF/LEF通路，其通路的拮抗劑有Dickkopf-1、SFRPs、Cerberus、Wnt抑制因子-1(WIF-1)[10]和內皮抑素(endostatin)[11]。其中，SFRPs作為Wnt信號通路的拮抗因子，常由于其啟動子CpG島的高甲基化致該基因表達沉默，而導致結腸癌、乳腺癌、黑色素瘤、肝癌、胃癌等惡性腫瘤發生[4]。

SFRPs是能與Wnt直接結合的分泌型糖蛋白家族系列，定位于8p12-11.1染色體，由SFRPs基因編碼，其蛋白結構中含有半胱氨酸富含區域(cysteine-rich domain CRD)，此區域與Fz受體有30%～50%序列相似，能競爭性抑制Fz受體或與Wnt配體直接結合，當其發生基因沉默時引起Wnt信號持續存在，使β-catenin不能被降解而在細胞質內大量積聚，從而轉移至細胞核內與TCF/LEF轉錄因子發生作用，激活Wnt相關靶基因，導致細胞增殖而發生癌變。目前發現SFRPs家族的成員有SFRP1、SFRP2、SFRP3、SFRP4、SFRP5等[12]。本結果結果顯示，72例胃黏膜病變者中，SFRP1、SFRP2、SFRP4、SFRP5基因啟動子甲基化率分別為47.2%、50.0%、37.5%和41.7%；在異型增生組4者甲基化率分別為29.4%、35.3%、11.8%和23.5%，胃癌組分別為72.5%、75.0%、62.5%和65.0%；而在慢性胃炎組中未檢測到SFRPs基因啟動子甲基化；且胃癌組SFRPs基因啟動子甲基化率顯著高于慢性胃炎組。

H.pylori是已確認的胃癌Ⅰ類致癌原，其感染對于組織構成的損傷是促成因素。由于H.pylori的生長環境是堿性環境，當感染此菌時能破壞胃內本身正常的消化道黏膜的酸性環境，使正常的胃黏膜暴露于炎性細胞、損傷因子、各種致病菌的環境中，使胃黏膜發生病理改變，造成胃黏膜損傷，使胃內環境改變并導致一系列損傷反應，發生淺表性胃炎、萎縮性胃炎、胃黏膜上皮的腸上皮化生、異型增生等改變，以致上皮的惡性轉化，導致腺癌的發生[13]。本研究結果顯示，胃癌組、慢性胃炎組、異型增生組胃黏膜H.pylori感染率依次增加，且相關分析顯示H.pylori感染與SFRPs基因啟動子甲基化間無線性相關。H.pylori感染時啟動了癌基因過表達，還是甲基化后的基因更容易使胃黏膜感染H.pylori，還需要進一步的實驗研究探索。胃癌的分子病理基礎也不單單是這兩個方面就能決定的，它本身就是多基因、多信號通路及多種細胞因子共同作用的結果，但是H.pylori的感染與基因的甲基化并無直接關系[14]。

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