側柏炭對血熱出血證大鼠的作用及機制研究

柳佳，張麗，姚映芷，丁安偉，喻斌，單鳴秋，姚衛峰

[摘要] 目的：探討側柏炭對血熱出血模型大鼠的止血作用及機制。方法：采用干姜水煎劑15 g·kg^-1結合5%乙醇給藥15 d建立大鼠血熱出血模型，以云南白藥為陽性對照藥，同時給予側柏炭水煎劑（5.0，10.0 g·kg^-1）進行治療，考察大鼠一般體征（體重、飲食量、飲水量、二便及肛溫）變化，全自動血細胞分析儀測定白細胞計數（WBC）、紅細胞計數（RBC）、血紅蛋白含量（HGB）及紅細胞壓積（HCT），斷尾法測定出血時間（BT），血液流變儀測定全血和血漿黏度，凝血儀測定血漿凝血酶時間（TT）、活化部分凝血活酶時間（APTT）、凝血酶原時間（PT）及纖維蛋白原（FIB）含量，放射免疫法檢測血漿中與甲狀腺功能相關的生化指標三碘甲狀腺原氨酸（T3）、四碘甲狀腺原氨酸（T4）、反三碘甲狀腺原氨酸（rT3）及促甲狀腺激素（TSH）水平，病理學檢查肺組織變化。結果：造模后大鼠體重增長率減慢，飲食量、飲水量、尿量及體溫明顯增加，糞便量及糞便含水量明顯減少（P<0.05，P<0.01）；血漿T4水平升高、T3和rT3濃度明顯增加（P<0.05）、TSH濃度下降；WBC，RBC，HGB及HCT明顯升高（P<0.05，P<0.01），全血高、中、低切黏度及血漿黏度顯著增加（P<0.01）；BT，TT，APTT顯著延長（P<0.01），FIB含量顯著增加（P<0.01）。灌胃給予云南白藥或側柏炭后，各組大鼠熱象體征有明顯改善（P<0.05，P<0.01）；凝血功能指標（BT，TT，APTT，FIB），甲狀腺功能指標（T4，T3，rT3，TSH），WBC，RBC，HGB，HCT，全血黏度及血漿黏度漸趨于正常（P<0.05，P<0.01），且光鏡下觀察發現，各給藥組大鼠肺組織病理性出血現象有所改善。結論：側柏炭可通過抑制甲狀腺功能、糾正血液流變學及凝血功能異常，改善血熱出血大鼠的熱象體征及病理性出血，發揮涼血止血功效。

[關鍵詞] 側柏炭；血熱出血；甲狀腺功能；凝血功能；血液流變學；涼血止血

側柏葉為柏科植物側柏Platycladus orientalis （L.） Franco的干燥枝梢及葉，又名柏葉、叢柏葉、云片柏。始載于《神農本草經》，列為木部上品，其味苦澀，性寒，歸肺、肝、脾經，具有涼血止血、化痰止咳、生發烏發之功效，臨床可用于治療出血、痛風、風濕性關節炎、感冒、咳嗽、支氣管炎、哮喘、高血壓以及激素混亂引起的多毛癥和脫發等疾病[1]。側柏葉具有止血、抑菌、抗炎、抗氧化、防脫發及神經保護等作用，炒炭后，其寒涼之性減弱，止血功效增強[2]，但止血作用機制及有效成分尚不明確。以往學者大多采用正常動物或體外實驗研究側柏葉的止血功效，而對側柏炭的研究甚少，本課題組通過前期研究，以干姜水煎劑為造模用藥，建立了符合中醫臨床辨證特點的大鼠血熱出血模型[3]，故本實驗擬運用該模型對側柏炭涼血止血功效進行驗證，并對其作用機制進行初探。

1 材料

1.1 動物及分組 SD大鼠，SPF級，雄性，體重180～220 g，由浙江省實驗動物中心提供，合格證號SCXK（浙）2008-0033。

1.2 藥物 干姜飲片購自亳州市永剛飲片廠有限公司（批號120216），經南京中醫藥大學中藥鑒定教研室吳啟南教授鑒定為姜科植物姜Zingiber officinale Rosc.的干燥根莖。生側柏葉購自河南輝縣，經南京中醫藥大學中藥鑒定教研室吳啟南教授鑒定為柏科植物側柏P. orientalis的干燥枝梢和葉。側柏炭則是將所購生品按藥典規定炒至表面焦褐色，內部焦黃色的自制炭品。云南白藥購自云南白藥集團股份有限公司（批號ZI11023）。

1.3 儀器及試劑 LG-PABER血小板聚集凝血因子分析儀（北京世帝科學儀器公司）；血液流變儀（北京中勤世帝科學儀器有限公司）；MEK-6318K全自動血細胞分析儀（日本光電工業株式會社）；r-911全自動放免計數儀（中國科技大學實業總公司）；離心機（上海安亭科學儀器廠）；DT-1TB電子體溫計（上海華晨醫用儀表有限公司）；PIR-200紅外測溫儀（西安啟悅測控技術有限公司）；無水乙醇（無錫市亞盛化工有限公司，批號20100612）；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na，國藥集團化學試劑有限公司，批號F20101222）；枸櫞酸納（天津市科密歐化學試劑開發中心，批號20051006）；EDTA（國藥集團化學試劑有限公司，批號T20090224）；水合氯醛（天津市科密歐化學試劑有限公司，批號20080323）；試劑盒：凝血酶時間（TT，批號STG20301-35A）、纖維蛋白原（FIB，批號STG20401-35）、凝血酶原時間（PT，批號STG20101-49）、活化部分凝血活酶時間（APTT，批號ST20201-55），均購自北京中勤世帝科學儀器有限公司。放免試劑盒：三碘甲狀腺原氨酸（T3，批號20120402）、四碘甲狀腺原氨酸（T4，批號20120405）、反三碘甲狀腺原氨酸（rT3，批號20120401）、促甲狀腺激素（TSH，批號20120409）均購自北京華英生物技術研究所。

2 方法

2.1 供試品的制備 稱取適量羧甲基纖維素鈉粉末，加水煎煮至粉末完全溶解，制成0.5% CMC-Na溶液。稱取干姜飲片適量，加8倍量水浸泡1 h，煎煮1 h，趁熱過濾，殘渣再加8倍量水煎煮2次，每次1 h，趁熱過濾；合并3次濾液并濃縮至1.5 kg·L^-1，即為干姜水煎劑。稱取云南白藥粉末適量，用0.5% CMC-Na溶液研勻，配置成質量濃度為0.05 g·mL^-1的混懸液，即為云南白藥混懸液。取生側柏葉適量，按《中國藥典》2010版一部（附錄ⅡD）側柏炭（Platycladi Cacumen Carbonisatum，PCC）炮制方法制備標準側柏炭飲片；稱取側柏炭適量，加15倍量水煎煮2次，每次2 h，趁熱過濾，合并濾液并濃縮成浸膏；稱取該浸膏適量，以0.5% CMC-Na溶液溶解并稀釋至1.0，0.5 g·mL^-1（按生藥量計算），即為側柏炭水煎劑高、低劑量。以上藥液均置于0 ℃冰箱保存備用。側柏炭高、低劑量分別為臨床等效劑量的8倍和4倍，即10.0，5.0 g·kg^-1。

2.2 造模及給藥 將大鼠置于溫度18～27 ℃，濕度45%～75%，氣流10～25 cm·s^-1，噪音低于50分貝的安靜環境中飼養。大鼠隨機分為5組：空白組、模型組、陽性組、側柏炭高、低劑量組，每組8只。空白組大鼠自由飲水，其余各組大鼠以5%乙醇代替自由飲水。早晨，模型組、陽性組、側柏炭高、低劑量組大鼠灌胃給予干姜水煎劑，給藥體積為10 mL·kg^-1（體重），空白組給予等體積蒸餾水；7 h后，陽性組灌胃給予云南白藥混懸液，側柏炭高、低劑量組分別給予10.0，5.0 g·kg^-1的側柏炭水煎液，空白組和模型組給予等體積0.5% CMC-Na溶液，給藥體積均為10 mL·kg^-1（體重），連續給藥15 d。

2.3 飲食量、飲水量、尿量、糞便量及體重增長率測定 分別于給藥第7天和第14天，將各組大鼠置于代謝籠中飼養，以24 h為時間單位，監測各組大鼠飲食量、飲水量、尿量及糞便量的變化，連續觀察2 d，并計算各組大鼠每100 g體重的飲食量、飲水量、尿量和糞便量，取其平均值。分別于給藥前和給藥后第15天，測定各組體重，并計算體重增長率=（第15天體重-給藥前體重）/給藥前體重×100%。

2.4 糞便含水量測定 分別于給藥第7天和第14天，每組大鼠各取新鮮糞便1粒，測得濕重后，置烘箱105 ℃干燥5 h后，冷卻至恒重，測得其干重，并計算糞便含水量= [（濕重-干重）/濕重]×100%。

2.5 肛溫測定 于給藥前、給藥7 d后及給藥14 d，分別測定各組大鼠肛溫。

2.6 血常規測定 第14天，灌胃干姜水煎劑40 min后，各組大鼠眼眶靜脈叢采血，EDTA 1∶9抗凝，測定WBC，RBC，HGB和HCT。

2.7 出血時間的測定 第14天，灌胃給予治療藥物40 min后，按文獻方法[4]，在距尾尖5 mm處橫斷，開始記錄時間，并用濾紙蘸血，每隔30 s蘸1次，直至出血停止，即為出血時間。

2.8 血液黏度及凝血功能指標測定 第15天，給藥40 min后，各組大鼠以10%水合氯醛麻醉，頸總動脈取血，3.8%枸櫞酸鈉1∶9抗凝，1 mL全血分裝測定全血高、中、低切黏度，剩余全血以3 000 r·min^-1離心10 min，取血漿，測定血漿黏度，TT，APTT，FIB及PT。

2.9 甲狀腺功能相關生化指標測定 取血漿，按試劑盒說明書操作，測定各組大鼠血漿中T3，T4，rT3和TSH的濃度。

2.10 組織學檢查 大鼠取血后，處死，取肺組織，生理鹽水清洗，肉眼觀察出血情況。取右肺葉以10%甲醛固定，石蠟包埋、蘇木素-伊紅染色、切片，光鏡下觀察組織的病理變化。在100倍光鏡下選取5個不重疊的視野，根據①肺泡壁增厚程度、②肺間隔充血、③間質出血、④肺泡腔狹窄、⑤炎癥細胞浸潤評價肺損傷程度，每項評0～4分，0分，正常；1分，輕度即累及<25%肺組織；2分，中度即累及25%～50%肺組織；3分，重度即累及50%～75%肺組織；4分，極嚴重即累及>75%肺組織[5]。

2.11 統計學方法 實驗數據采用SPSS 13.0軟件進行統計分析，各組數據以±s表示，各組間比較采用t檢驗分析，P﹤0.05為有統計學意義。

3 結果

3.1 側柏炭對血熱出血模型大鼠一般體征的影響 與空白組比較，模型組大鼠體重增長率減慢（P<0.01），飲食量、飲水量、尿量及肛溫明顯升高（P<0.05，P<0.01），糞便量及糞便含水量減少（P<0.01）。與模型組比較，云南白藥可明顯提高大鼠體重增長率（P<0.05），使飲水量、尿量及肛溫明顯下降（P<0.05，P<0.01），糞便量及糞便含水量明顯增加（P<0.05）；高、低劑量的側柏炭水煎劑均可使體重增長率顯著提高（P<0.01），飲食量、飲水量、尿量及肛溫顯著降低（P<0.05，P<0.01），糞便量及糞便含水量明顯增加（P<0.05，P<0.01），見表1。

3.2 側柏炭對血熱出血模型大鼠血常規及血液流變學相關指標的影響 與空白組比較，模型組大鼠WBC，RBC，HGB，HCT明顯增加（P<0.05，P<0.01），全血高、中、低切黏度及血漿黏度顯著增加（P<0.01）。與模型組比較，云南白藥可使血熱出血模型大鼠WBC，RBC，HGB和HCT明顯減少（P<0.05，P<0.01），全血高、中、低切黏度及血漿黏度明顯降低（P<0.05， P<0.01）；高、低劑量的側柏炭水煎劑均可明顯降低WBC，RBC，HGB，HCT，全血各切變率黏度及血漿黏度（P<0.05， P<0.01），見表2， 3。

3.3 側柏炭對血熱出血模型大鼠凝血功能相關指標的影響 與空白組比較，模型組大鼠BT，TT和APTT顯著延長（P﹤0.01），FIB含量顯著增加（P﹤0.01），PT明顯縮短（P﹤0.01）。與模型組比較，云南白藥可明顯縮短血熱出血模型大鼠BT，TT和APTT（P﹤0.05，P﹤0.01），顯著降低FIB含量（P﹤0.01），使PT明顯延長（P﹤0.05）；高、低劑量的側柏炭水煎劑可明顯縮短BT，TT和APTT（P﹤0.05，P﹤0.01），使FIB含量明顯降低（P﹤0.05，P﹤0.01），PT明顯延長（P﹤0.05，P﹤0.01），且隨劑量增加作用越明顯，見表4。表3 側柏炭對血熱出血模型大鼠全血及血漿黏度的影響 （±s，n=8）

3.4 側柏炭對血熱出血模型大鼠甲狀腺功能相關指標的影響 與空白組比較，模型組大鼠血漿T4含量有升高趨勢，T3，rT3濃度明顯增加（P﹤0.05），TSH濃度有降低趨勢。與模型組比較，云南白藥可明顯降低血熱出血模型大鼠血漿中T4，T3水平（P﹤0.05，P﹤0.01），使rT3濃度有下降趨勢；高、低劑量的側柏炭水煎劑均可明顯降低血漿中T4，T3，rT3濃度（P﹤0.05，P﹤0.01），使血漿TSH水平明顯升高（P﹤0.05），見表5。

3.5 側柏炭對血熱出血模型大鼠肺組織的影響 空白組大鼠肺間隔及支氣管結構清晰，肺泡結構清晰，上皮完整，肺泡壁毛細血管無擴張，腔內無滲出物，無出血。造模后大鼠肺泡間隔毛細血管擴張充血，纖維組織增生，肺間質出血，肺泡腔內多有紅細胞浸潤，部分肺泡結構被破壞，局部有炎細胞浸潤（P﹤0.01）。治療后，云南白藥及側柏炭水煎劑低、高劑量可顯著抑制炎細胞浸潤（P﹤0.01），明顯改善肺間質出血、間隔充血、肺泡壁增厚等病理改變（P﹤0.05，P﹤0.01），對血熱出血模型大鼠肺出血表現出不同程度的止血作用，見表6，圖1。

4 討論

本課題在前期研究中建立了符合中醫臨床辨證用藥特點的大鼠血熱出血模型[3]，通過預試驗發現，側柏炭水煎劑2.5 g·kg^-1（相當于臨床等效量的2倍）對該血熱出血模型止血效果不佳，故本試驗采用5.0，10.0 g·kg^-1劑量的側柏炭水煎劑為研究對象，初步探討其止血作用及機制。

干姜水煎劑可通過促進肝糖原分解、提高琥珀酸脫氫酶（SDH）活性，促進ATP的生成，并通過提高肝組織中Na⁺-K⁺-ATP酶及Ca²⁺-ATP酶活性，促進ATP的消耗[6]；甲狀腺激素可通過誘導細胞膜 上Na⁺-K⁺-ATP酶的生成，促進ATP分解，增加機體耗氧量，使產熱增加。血循環中甲狀腺激素的水平受下丘腦-垂體-甲狀腺軸的調節，下丘腦室旁核神經元分泌的促甲狀腺激素釋放激素（TRH）作用于垂體神經元，促進TSH分泌，TSH作用于甲狀腺以維持血液中T3，T4的正常，同時，血液中甲狀腺激素含量的變化可反饋性調節下丘腦TRH和垂體TSH分泌[7]。本實驗中，模型組大鼠血漿中T4，T3及rT3含量升高，TSH含量有下降趨勢，結合其肛溫升高、飲食量增加及體重增長率下降等一般體征變化，說明干姜水煎劑可通過促進甲狀腺激素T4，T3分泌，加速ATP消耗，提高機體的物質和能量代謝，使大鼠體溫升高、食欲增加，而體重增長率較慢，血循環中T3，T4水平升高又可反饋性抑制TSH分泌，使血液中TSH濃度下降；云南白藥粉末及高、低劑量的側柏炭水煎劑可顯著抑制T4，T3，rT3的分泌和生成，使大鼠體溫和飲食量下降、體重增長率增加，血循環中TSH濃度也相應升高，且隨給藥劑量增加側柏炭的作用越明顯。

血液黏度主要由紅細胞壓積、血漿黏度、紅細胞聚集性、紅細胞變形性等內在因素決定，其黏度值越大，血液流動性越差。HCT是影響全血黏度的重要指標之一，其增加可導致各切變率下全血黏度增加。血漿黏度主要由纖維蛋白原、球蛋白、白蛋白、脂類等因素決定，尤以纖維蛋白原含量對其影響最大。在本實驗中，模型組大鼠飲水量、尿量均明顯增加，而尿量增加幅度大于飲水量增加幅度，同時糞便量及糞便含水量顯著減少，全血高、中、低切黏度及血漿黏度顯著增加，RBC，HCT，HGB及FIB含量明顯增加，表明干姜辛熱之性入血分可耗傷津液，造成體內水分流失，使血液濃縮、黏滯性增加，導致全血及血漿黏度增加、凝血功能異常；而云南白藥粉末和高、低劑量側柏炭水煎劑可通過改善大鼠飲水量、尿量、糞便量及糞便含水量等一般體征，降低RBC，HCT，HGB及FIB含量，使全血及血漿黏度下降，從而改善血液流動性。

凝血過程主要包括內源性凝血途徑、外源性凝血途徑和共同凝血途徑。PT主要反映的是外源性凝血系統功能，其延長或縮短可表明血漿中外源性凝血因子水平降低或升高；APTT和TT的延長與內源系統凝血酶的抑制有關，其延長或縮短可表明血漿中凝血因子Ⅻ，Ⅺ，前激肽釋放酶Ⅴ，Ⅱ和Ⅰ水平的降低或升高[8]。本實驗中，模型組大鼠TT，APTT顯著延長，PT縮短，WBC及FIB含量增加，且病理學檢查可見肺組織局灶性出血及炎細胞浸潤，提示干姜長時間給藥可引起大鼠內源性凝血功能障礙及血液高黏狀態，導致大鼠肺出血；而云南白藥粉末及高、低劑量側柏炭水煎劑可顯著降低全血黏度及血漿黏度，明顯降低FIB含量，顯著抑制炎細胞浸潤，且病理學觀察可見各給藥組大鼠肺組織出血狀態均有不同程度改善，提示側柏炭水煎劑可通過改善血液粘稠度態、糾正凝血功能異常，發揮止血功效。

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Effects and mechanisms of Platycladi Cacumen Carbonisatum on rats with

blood-heat and hemorrhage syndrome

LIU Jia1， ZHANG Li1， YAO Ying-zhi2， DING An-wei1*， YU Bin3， SHAN Ming-qiu1， YAO Wei-feng1

（1. Jiangsu Key Laboratory for High Technology Research of Traditional Chinese Medicine Formulae， Nanjing University of

Chinese Medicine， Nanjing 210046， China； 2.Basic Medical School， Nanjing University of Chinese Medicine，

Nanjing 210046， China； 3. Province and Ministry Cooperation Lab of Pharmacology of Chinese Medicine， Nanjing University of

Traditional Chinese Medicine， Nanjing 210046， China）

[Abstract] Objective： To discuss the effect and mechanism of Platycladi Cacumen Carbonisatum（PCC） on rats with blood heat and hemorrhage syndromes. Method： Rats were fed with 15 g·kg^-1 water decoctions of Zingiberis Rhizoma and 5% alcohol for 15 days to establish the blood-heat and hemorrhage syndrome model. Yunnan Baiyao was taken as the positive control drug， and PCC decoctions （5.0， 10.0 g·kg^-1） were given simultaneously， in order to detect changes in general physical signs of rats， such as body weight， daily diet， volume of daily drinking and urine and stool， and rectal temperature. Automatic hematology analyzers was used to determine white blood cell （WBC）， red blood cell （RBC）， hemoglobin （HGB）， and hematocrit （HCT）， blood time by docking （BT）. Blood rheometers was used to detect whole blood and plasma viscosities， thrombin time （TT）， activated partial thromboplastin time （APTT）， prothrombin time （PT） and fibrinogen content （FIB）. Indexes related to thyroid functions， such as triiodothyronine （T3）， tetraiodothyronine （T4）， reverse triiodothyronine （rT3） and thyroid stimulating hormone （TSH） were measured by radio-immunoassay， and changes in lung tissues were observed by hematoxylin-eosin （HE） stain. Result： After modeling， rats witnessed slowdown in weight growth rate， significant increase in daily diet， volume of daily drinking， urine and temperature， significant decrease in stools and their water content （P<0.05， P<0.01）， rise in plasma T4 level， notable growth in T3 and rT3 concentrations （P<0.05）， decline in TSH concentration. Additionally， their WBC， RBC， HGB and HCT remarkably increased （P<0.05， P<0.01）， with significant increase in high， middle and low whole blood viscosities and plasma viscosity （P<0.01）； their BT， TT， APTT were notably prolonged （P<0.01）， with significant increase in FIB content （P<0.01）. After oral administration of Yunnan Baiyao or PCC， rats of all groups showed significant improvement in blood heat syndromes （P<0.05， P<0.01）， and their blood coagulation indexes including BT， TT， APTT， FIB， thyroid function indexes including T4， T3， rT3， TSH， WBC， RBC， HGB， HCT， whole blood viscosity and plasma viscosity were getting normal （P<0.05， P<0.01）. Conclusion： PCC can ameliorate blood heat symptoms and pathologic hemorrhage among rats with blood heat and hemorrhage syndromes by inhibiting thyroid functions and correcting hemorheological and coagulation disorders.

[Key words] Platycladi Cacumen Carbonisatum； blood heat and hemorrhage syndromes； thyroid function； blood coagulation； hemorheology； to cool blood and stop bleeding

doi：10.4268/cjcmm20130216

[責任編輯 張寧寧]