原人參二醇脂質立方液晶納米粒在大鼠體內的藥動學研究

金鑫，張振海，孫娥，劉其媛，賈曉斌

[摘要] 目的： 本研究旨在建立高效液相色譜-串聯質譜測定大鼠血漿中原人參二醇的方法，分析原人參二醇脂質立方液晶納米粒、原人參二醇原料藥的藥代動力學特征。 方法： SD大鼠分別灌胃給予原人參二醇（PPD）、原人參二醇脂質立方液晶納米粒后，定時眼眶取血，0.05%甲酸甲醇-0.05%甲酸水（95∶5）為流動相。采用電噴霧離子化四極桿串聯質譜，以全掃描檢測（SCAN）方式進行檢測，用于定量分析的二級碎片離子分別為m/z 460.4/425.3（PPD）和m/z 622.9/587.4（Rh2，內標），檢測血漿中的原人參二醇含量，繪制藥時曲線，DAS程序計算藥動學參數。 結果：PPD血漿濃度測定方法的線性范圍為10～1 407 μg·L^-1，定量限為2.5 μg·L^-1。日內、日間精密度 （RSD） 均小于13 %，準確度（RE）在±8.5%之內。 結論：該方法專屬性強，靈敏度高，血漿用量少，適用于藥代動力學研究。制備成原人參二醇脂質立方液晶納米粒可以促進原人參二醇在體內的吸收，其相對生物利用度為原料藥的166%。

[關鍵詞] 原人參二醇；立方液晶；生物利用度；高效液相色譜-串聯質譜法

-原人參二醇（PPD）是原人參二醇組皂苷（包括Rb₁， Rb₂， Rb₃， Rc， Rd， Rg₃，Rh₂）的苷元，具有顯著的抗癌效果[1-3]。PPD具有抑制癌細胞轉移，改變癌細胞膜完整性，終止癌細胞的細胞周期，誘導癌細胞細胞凋亡等作用，使其成為人參皂苷中具有最強的抗癌活性的皂苷類成分之一[4-7]。研究表明，PPD溶解性差，口服生物利用度低[8]，半衰期短。因此需要采用適宜的制劑改善其口服生物利用度。

脂質立方液晶由于良好的生物降解性和促吸收效果好的特點，近年來逐漸被關注和研究[9-10]。其通常是由極性脂質在含水環境中通過吸附定量的水自發的形成具有特殊內部結構的類凝膠相立方骨架結構，具有較強的黏膜黏附性，從而促進藥物跨膜吸收[11-13]。作者采用單油酸甘油酯和泊洛沙姆407制備了自組裝閉合脂質雙層“蜂窩狀”結構的立方液晶納米粒包裹PPD，增加其與腸道細胞的親和性，以促進PPD口服吸收[14]。

因此，本研究旨在建立高效液相色譜-串聯質譜測定大鼠血漿中原人參二醇的方法，分析原人參二醇脂質立方液晶納米粒、原人參二醇原料藥的藥代動力學特征，從而為PPD脂質立方液晶制劑的開發和臨床藥代動力學研究提供工作基礎和理論依據。

1 材料

Agilent 6410A 四級桿 LC-MS 系統 （包括G1311A 四元泵，G322A 脫氣泵，G1329 自動進樣器，G1216A 柱溫箱，Agilent 化學工作站） （美國 Agilent 公司），氮吹儀（美國Organomation公司），KQ-100B型超聲波清洗器（混山市超聲儀器公司），XW-80A微型漩渦混合儀（上海滬西分析儀器廠有限公司）； Millipore超純水儀（Millipore，Bedford，MA，美國），TGL-16G臺式離心機（上海安亭科學儀器廠），IKAT25高速剪切乳勻機（德國IKA集團）

原人參二醇（PPD，南京澤朗有限公司，批號111747-201107）；人參皂苷Rh2對照品（上海順勃有限公司，批號960212）；單油酸甘油酯（GMO，丹麥丹尼斯克，DIMODANMO/D，純度≥90%，批號11670，批號WPHB615B）；泊洛沙姆 407 （ F127，德國 BASF）；甲醇（色譜純，美國Tedia公司）

SD大鼠，雌雄兼有，體重200～250 g ，由SLEK上海動物實驗中心提供，合格證為SCXK（滬）2007-0005。

2 方法

2.1 脂質立方液晶的制備

稱取單油酸甘油酯和泊洛沙姆407于恒溫水浴中熔融，加入一定量的原人參二醇溶解后，再緩慢加入一定量的水，渦旋混勻，超聲，室溫下放置。形成透明凝膠后，加入一定量的水，用高速攪拌機攪拌制成粗分散體系，再高壓勻質，制備成粒徑均勻的立方晶納米粒。

2.2 透射電鏡觀察原人參二醇脂質立方液晶納米粒的形態

純化后取待檢樣品加水稀釋，滴至覆有支持膜的銅篩網上，靜置 3 min，用濾紙從銅網的邊上吸去多余的液體，以 1%醋酸雙氧鈾染色，自然干燥 15 min （必要時紅外加熱干燥），用透射電鏡Jeol JEM-1400 （加速電壓為80 kV）觀察樣品形態，并拍攝照片。

2.3 給藥方案

SLEK上海動物實驗中心SD大鼠12只，200～220 g，雌雄各半，給藥前禁食12 h，不禁水。平均分為2組，分別灌胃給予PPD和PPD立方液晶，劑量為（2.0±0.2） mg·kg^-1，分別于給藥后0，0.25，0.5，1.0，1.5，2.0，3.0，4.0，6.0，8.0，12.0 h于大鼠眼眶取血0.5 mL；采血后離心5 min （3 000 r·min^-1），取血漿，于-20 ℃保存待測。

2.4 對照品溶液的制備

精密稱取PPD對照品10 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，配制成1 g·L^-1的儲備液，于4 ℃保存。臨用前，取對照品儲備液適量，先用甲醇稀釋成0.001 mg·L^-1，再按倍數稀釋法稀釋至所需濃度，即得。

2.5 內標溶液制備

精密稱取PPD對照品10 mg，置于10 mL 量瓶中，加甲醇定容至刻度，配制成1 g·L^-1的儲備液，于4 ℃保存。臨用前，加甲醇稀釋成1 mg·L^-1，即得。

2.6 血漿樣品處理

取血漿樣品100 μL，加入內標溶液10 μL，加入乙酸乙酯1.1 mL，渦旋3 min，離心11 000 r·min^-1，15 min，取上清液，N2下吹干，加入甲醇100 μL復溶，渦旋30 s，11 000 r·min^-1離心15 min，取上清液進行HPLC-MS分析。

2.7 質控樣品的制備

取血漿樣品100 μL，先加入樣品溶液和內標溶液，再加入乙酸乙酯1.1 mL，渦旋3 min，離心11 000 r·min^-1，15 min，取上清液，N ₂下吹干，加入甲醇100 μL復溶，渦旋30 s，11 000 r·min^-1離心15 min，取上清液進行HPLC-MS分析。

2.8 色譜條件

ZORBAX SB C ₁₈柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相0.05%甲酸甲醇-0.05%甲酸水（95∶5）；流速1.0 mL·min -1；柱溫30 ℃；進樣體積為10 μL。

2.9 質譜條件

毛細管電壓4.0 kV，霧化器壓力275.8 kPa，干燥氣流速10 L·h-1，輔助氣溫度350 ℃；離子檢測方式全掃描檢測（SCAN），離子極性正離子（ positive），離子化方式氣動輔助電噴霧離子化（ESI），掃描范圍m/z 100～1 000。

2.10 數據處理

用 SPSS 11.0統計軟件對各時間點的血藥濃度進行計算，繪制血藥濃度-時間曲線。各血藥濃度-時間曲線用 DAS 2.0藥代動力學程序進行房室模型模擬，計算主要的藥動學參數， 數據以±s的形式表示。

3 結果

3.1 原人參二醇脂質立方液晶納米粒的表征

透射電鏡觀察結果表明，原人參二醇脂質立方液晶納米粒的形狀為明顯的方形結構，粒徑約為60 nm（圖1），不同于普通脂質體的內部同心圓的“指紋狀”多層囊泡結構。

3.2 質譜分析

本方法用正離子方式檢測，質譜圖中獲得內標人參皂苷Rh2的質譜圖（圖2A），其準分子離子[M+H]⁺峰m/z 622.9，生成主要碎片離子m/z 587.4，用于定量分析。PPD準分子離子峰m/z 460.4的質譜圖（圖2B），生成主要碎片離子m/z 425.3用于定量分析。

3.3 方法學考察

3.3.1 方法的專屬性 取空白大鼠血漿200 μL，除不加標準溶液外，其余按2.6項下依法操作，進樣10 μL，在1.71，3.41 min均無內源性干擾（圖3A）；將一定濃度的PPD標準溶液和內標標準溶液加入空白血漿中，除不加流動相外，依同法操作，PPD的保留時間為3.41 min（圖3B），內標物的保留時間為1.71 min。取給藥后1.5 h收集的血漿樣品，按2.6項下依法操作，結果表明，空白血漿中內源性物質不干擾PPD及內標物的測定。

3.3.2 標準曲線和定量限 精密量取PPD對照品14.07 mg于10 mL量瓶中，配制成質量濃度為1 407，703，351，175，88，44，22，10 μg·L^-1的PPD對照品溶液。分別加入藥品使血清中PPD質量濃度為1 407，703，351，175，88，44，22，10 μg·L^-1，同時加入200 μg·L^-1人參皂苷Rh2 10 μL作為內標，每組平行取大鼠空白血漿3份，按2.6方法處理。吸取此溶液10 μL進樣，記錄峰面積。以對照品實際濃度為橫坐標，以PPD與內標物峰面積比為縱坐標，進行線性回歸，得標準曲線Y=0.002 9X-0.088 3（r=0.997 8），線性范圍為5～1 400 μg·L^-1，且線性關系良好。最低檢測限為信噪比的10倍（S/N=10）為2.5 μg·L^-1。

3.3.3 精密度與準確度 以空白血清配制高、中、低（1 000，100，10 μg·L^-1）3個質量濃度的PPD溶液，按2.6操作，平行測定5次，分別計算其RSD，10，100，1 000 μg·L^-1的PPD對照品溶液加入200 μg·L^-1人參皂苷Rh ₂ 10 μL作為內標的RSD，日間差和日內差的計算分別1 d內樣品平行5次，同樣方法連續3 d進樣，結果表明精密度良好（表1）。

3.3.4 回收率 以空白血漿配制高、中、低（1 000，100，10 μg·L^-1）3個質量濃度的PPD溶液，所得溶液按2.6操作，進樣，平行測定5次，以實際測得量與理論加入量的比值計算提取回收率，10，100 ，1 000 μg·L^-1的PPD對照品溶液的提取回收率均大于68%，且RSD分別為14%，8.5%，6.7%，表明提取回收率良好。方法回收率，以實際測得量與加入到生物基質中已知量的對照品產生的響應值比值，10，100 ，1 000 μg·L^-1的PPD對照品溶液的方法回收率均大于86%，且RSD分別為9.8%，8.2%，6.3%，表明方法回收率良好（表2） 。

3.3.5 穩定性考察 以空白血漿配制高、中、低（1 000，100，10 μg·L^-1）3個質量濃度的PPD溶液，測定4 ℃放置24 h、冷凍1 d、凍融3次、-20 ℃存放3周對PPD的穩定性的影響。結果表明在上述條件下PPD的穩定性良好（表3）。

3.4 HPLC-MS測大鼠血漿中PPD的含量

大鼠灌胃給藥原人參二醇和原人參二醇脂質立方液晶納米粒（2 mg·kg^-1 PPD），測得其血漿中PPD的濃度變化，得平均血藥濃度-時間曲線（n=6）（圖4）。口服給藥PPD達峰濃度Cmax為73.45 μg·L^-1，達峰時間Tmax約為85 min。原人參二醇脂質立方液晶納米粒的達峰濃度Cmax為100.14 μg·L^-1，達峰時間Tmax約為125 min。原人參二醇和原人參二醇脂質立方液晶納米粒的達峰時間和達峰濃度都具有顯著的差別。原人參二醇和原人參二醇脂質立方液晶納米粒的曲線下面積分別為28.01，46.45 mg·min ·L^-1（表4）。由此可見，PPD在體內的血藥濃度在1.5 h內達到峰值，提示其在大鼠體內吸收較快。而PPD立方液晶使PPD的Tmax有所延后，Cmax顯著提高，并且有一個緩慢釋放的過程，增加了藥物在體內的滯留時間，其相對生物利用度是原料藥的1.66倍。

4 討論

原人參二醇的分子結構中缺少雙鍵共軛基團，紫外吸收較差，且最大吸收波長主要在 203 nm 處，且此處干擾較為強烈，因此常用的高效液相色譜-紫外檢測方法無法完成對生物樣品中低含量的原人參二醇的定量分析，因此選擇靈敏度更高的質譜檢測方法。但是原人參二醇質譜檢測方法也存在較大難度，呈現在選擇反應監測方式下反應離子對的選擇，對原人參二醇對照品進行一級全掃描時發現，原人參二醇很難進行負離子化，正離子化條件下分子離子峰只有[M+N_a]⁺，未見[M+NH₄]⁺和[M+1]⁺峰，且峰度并不理想。選擇[M+1] +進行二級碎片離子掃描，出現脫去2分子水的特征碎片m/z 425.3，峰度較好，因此選擇其用于定量分析。

對于生物樣品的預處理，曾先后嘗試使用固相萃取、沉淀蛋白和液-液萃取的方法。由于原人參二醇結構中疏水性基團較多，易于用有機溶劑進行液-液萃取和固相萃取。利用乙酸乙酯溶液進行液-液萃取可獲得較高提取率（約為70%）。固相萃取法很容易將原人參二醇從生物樣本中分離出來，但固相萃取時需用甲醇進行洗脫，若對洗脫液不進行濃縮，達不到實驗所需的靈敏度要求，若進行濃縮，則增加了實驗步驟，過于繁瑣，不易于應用。蛋白沉淀法雖然簡單易行，但是沉淀法的高污染性不利于質譜儀的使用。因此，本實驗選擇了快速、靈敏度高、重復性好的的液-液萃取進行生物樣本前處理。

PPD血漿濃度測定方法的線性范圍為10～1 407 μg·L^-1，定量限為2.5 μg·L^-1。日內、日間精密度 （RSD） 均小于13%，準確度（RE）在±8.5%之內。本方法專屬性強，靈敏度高，血漿用量少，適用于藥代動力學研究。

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Study on pharmacokinetics of 20（S）-protopanaxadiol

lipid cubic nanoparticles

JIN Xin， ZHANG Zhen-hai， SUN E， LIU Qi-yuan， JIA Xiao-bin*

（Hospital of Chinese and Western Integrated Medicine affiliated， Nanjing University of

Chinese Medicine， Nanjing 210028， China）

[Abstract] Objective： To establish a high-performance liquid chromatographic/tandem mass spectrometry （HPLC-MS/MS） method for determining 20（S）-protopanaxadiol （PPD） in rat plasma， in order to analyze pharmacokinetic characteristics of PPD and PPD cubic nanoparticles. Method： Sprague-Dawley rats were administered orally with PPD and PPD cubic nanoparticles， respectively. Their blood samples were obtained from fossa orbitalis at regular time points. The mobile phase was 0.05% formic acidac etonitrile-0.05% formic acidac water （95∶5）. Electrospray ionization （ESI） was adopted for the quadrupole tandem mass spectrum. SCAN mode was used for the quantitative analysis， with m/z 460.4/425.3 and m/z 622.9/318.3 （Rh2， interior label） as secondary fragment ions. The concentration of PPD in plasma was analyzed. The concentration-time curve was mapped. The data were calculated by DAS program. Result： The linearity of the PPD plasma concentration determination method ranged between 10-1 407 μg·L^-1， with the limit of quantification of 2.5 μg·L^-1. Both of the inter-day and intra-day precisions （RSD） were less than 13.25%， and the accuracy （relative error） was between ±8.50%. Conclusion： The method was so highly specific and sensitive with less plasma that it is suitable for pharmacokinetic studies. The prepared 20（S）-protopanaxadiol lipid cubic nanoparticles can enhance its absorption in vivo. Its relative bioavailability is 166% of the raw material.

[Key words] PPD； cubic nanoparticles； bioavailability； HPLC-MS

doi：10.4268/cjcmm20130223

[責任編輯 陳玲]