高速逆流色譜結合硅膠柱色譜法分離制備干姜中的6－姜酚、8－ 姜酚、6－姜烯酚

徐美霞，王曉，劉建華，耿巖玲，王岱杰，劉峰*

(1.山東農業大學食品學院，山東 泰安，271000;2.山東省分析測試中心，山東 濟南 250014)

干姜是姜科植物Zingiber officinale Rosc.的干燥根莖，具有溫中散寒，回陽救逆，燥濕消痰的功效，中醫常用于治療脘腹冷痛、嘔吐泄瀉、肢冷脈微和痰飲喘咳等癥［1］。姜酚是姜中主要的辣味和生物活性成分，主要有 6－姜酚、8－姜酚、10－姜酚、6－姜烯酚、8－姜烯酚以及 10－姜烯酚等［2－3］。研究表明，姜酚具有健胃與抗胃潰瘍、保肝利膽、抗血小板聚集、降血脂、抗動脈硬化、抗缺氧和保護心肌細胞等作用［4－6］。姜酚化學性質不穩定，易氧化，見光受熱易分解，且在姜中含量低，不易分離，到目前為止還沒有較理想的姜酚合成方法，因此建立相關成分的分離純化方法對干姜藥效研究及質量評價具有重要意義。

高速逆流色譜(HSCCC)是一種液液分配分離技術，不需要任何載體或支撐體作為固定相，排除了對樣品的不可逆吸附、沾染、變性、失活等影響，而且具有操作簡單、分離量大、分離時間短、樣品易回收、產品純度高等優點，因而廣泛應用于天然產物的分離制備［7－9］。本實驗建立了高速逆流色譜結合硅膠柱色譜法分離干姜中6－姜酚、8－姜酚、6－姜烯酚的方法，不僅簡便快捷，而且所得產物純度高、制備量大、分離效率高，可為干姜資源的進一步研究和開發利用提供技術支撐。

1 材料、儀器與試劑

儀器:GS10A高速逆流色譜儀(北京新技術研究所);HF－10B超聲循環提取儀(北京弘祥隆生物技術有限公司);Waters 600高效液相色譜儀(美國Waters公司，配PDA檢測器);Varian INOVA－600核磁共振波譜儀(美國Varian公司);Agilent 5973N質譜儀(美國Agilent公司)。旋轉蒸發儀R－3(瑞士BUCHI公司);HH－4型數顯恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司);硅膠G(200～300目)、薄層用硅膠板(青島海洋化工廠)。

試劑:石油醚、甲醇、乙酸乙酯、冰乙酸為分析純(天津廣成化學試劑有限公司);粗提物的制備及逆流色譜分離所用溶劑均為分析純(濟南巨業化學試劑有限公司)，HPLC分析用甲醇、乙腈為色譜純(山東禹王實業有限公司);水為二次蒸餾水。

材料:干姜購于安徽亳州藥材市場，經鑒定為姜科姜屬植物姜(Zingiber officinale Rosc.)的干燥根莖。

2 實驗方法

2.1 樣品的提取

干姜粉碎后過60目篩，準確稱取1.0kg于超聲循環提取儀中，加入10 L乙酸乙酯，超聲提取40min，抽濾，減壓蒸餾回收乙酸乙酯，重復提取3次，蒸干溶劑得到干姜浸膏。

2.2 硅膠柱色譜分離

取上述干姜浸膏，用硅膠柱色譜法進行分離，以石油醚－乙酸乙酯梯度洗脫，經薄層色譜檢測，合并相同組分得到A1～A6六段餾分，選取A3和A4兩個餾分進行高速逆流色譜分離。

2.3 兩相溶劑體系和樣品溶液的制備

A4餾分所用高速逆流色譜溶劑體系為石油醚 － 乙酸乙酯 － 甲醇 － 水(1∶0.5∶0.8∶0.7，V/V);A3餾分所用高速逆流色譜溶劑體系為石油醚－乙酸乙酯－甲醇－水(1∶0.5∶1∶0.5，V/V)。分別將其按比例配制于分液漏斗中并劇烈震蕩使其混合均勻，靜置分層，上層為固定相，下層為流動相。

分別稱取A4餾分400mg，A3餾分220mg，并分別加入5 mL上相、5 mL下相超聲溶解，以備逆流色譜分離用。

2.4 高速逆流色譜分離

首先將固定相以9 mL/min流速充滿逆流色譜分離柱，然后開啟速度控制器使逆流色譜儀的色譜分離柱正轉達到800 r/min，以2 mL/min流速泵入流動相，直至下相流出，達到動態平衡后，將溶解的樣品通過進樣器注入色譜柱，在254 nm波長下檢測色譜峰。

2.5 高效液相色譜條件

高效液相色譜條件:Inertsil C18色譜柱(250mm×4.6 mm，5 μm);流動相A:甲醇，流動相B:冰乙酸水溶液(體積分數0.2%);等度洗脫:0～25 min，A:75%，B:25%;流速:1 mL/min;檢測波長:279 nm;柱溫:室溫;進樣量:10 μL。

3 結果與討論

3.1 高效液相色譜條件優化

本實驗采用甲醇/水、乙腈/水，甲醇/冰乙酸水溶液(體積分數0.2%)，乙腈/冰乙酸水溶液(體積分數0.2%)等多個流動相體系對樣品進行高效液相色譜分析，結果表明，甲醇/冰乙酸水溶液(體積分數0.2%)體系出峰時間合適，各個峰能夠實現基線分離。最終采用甲醇/冰乙酸水溶液(體積分數0.2%)(二者體積比75:25)對樣品進行分析，所得色譜圖如圖1所示。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

3.2 逆流色譜的溶劑系統優化

選擇合適的兩相溶劑系統是逆流色譜分離純化天然植物中活性成分的關鍵。本實驗根據所分離化合物的特性，考察了不同體系氯仿－甲醇－水、乙酸乙酯－甲醇－水、石油醚－乙酸乙酯－甲醇－水對目標化合物的分離情況，結果發現，采用氯仿－甲醇－水，乙酸乙酯－甲醇－水體系時化合物難以完全分離，因此選擇石油醚－乙酸乙酯－甲醇－水作為溶劑系統，上相作為固定相，下相為流動相。根據A3餾分中目標化合物的極性，首先試用石油醚－乙酸乙酯－甲醇－水(1∶0.5∶0.9∶0.6，V/V)體系，結果發現各個化合物雖然達到基線分離，但出峰時間比較靠后，分離時間較長，因此調整甲醇/水的比例，增加化合物在流動相中的分配，于是將系統調整為石油醚－乙酸乙酯－甲醇－水(1∶0.5∶1∶0.5，V/V)，縮短分離時間。根據A4餾分中目標化合物的極性首先試用石油醚－乙酸乙酯－甲醇－水(1∶0.5∶0.9∶0.6，V/V)體系，結果發現各個化合物雖然呈現分開的趨勢，但未達到基線分離，說明化合物在下相中的分配多，因此調整甲醇/水的比例，減少化合物在下相的分配，于是將系統調整為石油醚 － 乙酸乙酯 － 甲醇 － 水(1∶0.5∶0.8∶0.7，V/V)，使各化合物得到良好的分離。

3.3 高速逆流色譜分離純化

以石油醚 － 乙酸乙酯 － 甲醇 － 水(1∶0.5∶0.8∶0.7，V/V)作為 A4 餾分的分離體系，一次性進樣400mg，分離時間180min，固定相保留率為72.7%，逆流色譜圖如圖2所示，主要得到A和B兩個化合物，分別進行HPLC 分析，用面積歸一化法測得其純度為99.63%、98.32%。其質量分別為63.80mg、22.36 mg。

以石油醚 － 乙酸乙酯 － 甲醇 － 水(1∶0.5∶1∶0.5，V/V)作為 A3 餾分的分離體系，一次性進樣220mg，分離時間300min，固定相保留率為62.5%，逆流色譜圖如圖3所示，主要得到化合物C，進行HPLC分析，用面積歸一化法測得其純度為98.02%。其質量為29.46 mg。

3.4 化合物的結構鑒定

化合物 A:ESI－MS(m/z):317［M+Na］+，293［M－H］﹣.1H NMR(CDCl3，600mHz):δ 6.60 ～6.80(3H，m，H ～2′，5′，6′)，6.05(1H，brs，－OH)，4.00(1H，m，－OH)，3.82(3H，s，－OCH3)，2.71 ～2.82(2H，m，H－1)，2.57(2H，m，H－4)，2.46(2H，t，J=7.2 Hz，H－5)，1.22 ～1.68(8H，m，H－6，H－7，H－8，H－9)，0.87(3H，t，J=7.2 Hz，－CH3)。以上數據與文獻［10］對照一致，鑒定為6－姜酚。

化合物 B:ESI－MS(m/z):345［M+Na］+，321［M－H］﹣.1H NMR(CDCl3，600mHz):δ 6.63 ～ 6.83(3H，m，H－2′，5′，6′)，5.64(1H，brs，－OH)，4.01(1H，m，－OH)，3.86(3H，s，－OCH3)，3.00(1H，brs，OH)，2.81(2H，t，J=7.2 Hz，H－1)，2.45(2H，t，J=7.2 Hz，H－2)，1.27 ～1.50(14H，m，H－5，6，7，8，9，10，11)，0.86(3H，t，J=7.2 Hz，－CH3)。以上數據與文獻［10］對照一致，鑒定為8－姜酚。

化合物 C:ESI－MS(m/z):299［M+Na］+，275［M－H］﹣.1H NMR(CDCl3，600mHz):6.80(1H，d，J=13.5 Hz，H－5)，6.70(1H，d，J=1.8 Hz，H－2′)，6.65(1H，dd，J=6.2 Hz，H－6′)，6.05(1H，d，J=14.5 Hz，H－4)，3.82(3H，s，－OCH3)，2.83(4H，m，H－1，H－2)，2.17(2H m，H－6)，1.41(2H，m，H－7)，1.29(4H，m，H－8，H－9)，0.87(3H ，t，J=7.1 Hz，H－10)。以上數據與文獻［11］對照一致，鑒定為6－姜烯酚。

4 討論

姜酚是干姜的重要活性成分，其標準物質的制備對干姜的質量評價和相關的藥理研究具有重要的意義。本實驗應用硅膠柱色譜結合高速逆流色譜法從干姜提取物中分離得到了純度大于98%的6－姜酚、8－姜酚、6－姜烯酚，具有純度高、制備量大、操作簡單等特點，對天然產物活性成分的快捷有效制備具有參考價值。

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