同時檢測淡水魚加工中土霉素和微囊藻毒素(MC-LR)殘留量

黨亞麗

摘?要：目的：土霉素是限制我國淡水魚深加工產品出口的關鍵抗生素之一；此外，由于水污染加重，淡水魚中藻毒素殘留問題也很嚴重。研究和開發同時快速檢測技術已成為當前急需解決的問題。方法：鯽魚魚肉進行不同前處理，利用高效液相色譜測定毒素殘留量。結果：土霉素和微囊藻毒素的最低檢測限分別為0.1μg/kg、5ng/L。質量濃度范圍0.1～5.0μg/mL的土霉素、微囊藻毒素標準品制備標準曲線，線性關系較好，相關系數分別為0.995、0.998。精密度分別為1.82%、1.68%；回收率范圍分別88.1%～102.8%、90.6%～105%。結論：對比酶聯免疫反應試劑盒的檢測，2種方法結果沒有太大差別。

關鍵詞：土霉素；微囊藻毒素(MC-LR)；高效液相色譜；同時檢測

中圖分類號：TS254.1 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123(2013)10-0009-03

土霉素(OTC)是水產養殖中治療活性氣單胞菌屬敗血癥及假單胞菌屬敗血癥的常用抗菌藥物之一[1]，微囊藻毒素(microcystin，MC-LR)是水體富營養化引起藻類(藍藻)大量繁殖所釋放的毒素。土霉素和微囊藻毒素的過度使用和環境惡化會引起這些毒素在魚體中的蓄積并導致細菌的耐藥性，具有免疫抑制影響導致肝損害等副作用。

檢測土霉素的方法主要有固相萃取和高效液相色譜法[2]。檢測微囊藻毒素的方法主要有高效液相色譜法、液質聯用法、酶聯免疫法等[3-6]。目前沒有同時檢測魚體中這2種毒素的方法。本實驗采用水洗、酸洗、堿洗、煮制、腌制5種不同的前處理方法后，建立1種能同時檢測土霉素和微囊藻毒素高效液相色譜方法。同時對比分析不同處理方法對殘留量的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鯽魚購買于當地菜市場。

乙腈、甲醇(色譜純)；磷酸二氫鈉。

1.2 儀器與設備

LC-20AT高效液相色譜儀 日本島津公司；高速離心機 上海盧湘儀離心機儀器有限公司；KKQ-100E超聲波清洗器 杭州蕭山余祝超聲波設備廠；HWS-12恒溫水浴鍋 上海滬粵明科學儀器有限公司；TAIKANG/R2002KE旋轉濃縮儀 上?；ゼ褍x器設備有限公司；S10高速勻漿機 杭州諾丁科學器材有限公司；HLB固相萃取柱 上海楚定分析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

1.3.1.1 水洗

鯽魚去刺取肌肉部分絞碎后，與4℃蒸餾水按3:1(mL/g)混合。用玻璃棒攪拌2min，4℃冷凍離心(10000×g，10min)。得到的沉淀按3:1(mL/g)加蒸餾水(4℃)，用玻璃棒攪拌2min，4℃冷凍離心(10000×g，10min)。得到的沉淀即是水洗脫腥魚糜。

1.3.1.2 酸堿洗

鯽魚去刺取肌肉部分絞碎后，按9:1(mL/g)加蒸餾水(4℃)，用勻漿機勻漿(10000r/min，30s)，魚漿用雙層紗布過濾除結締組織。調整pH值(酸提pH2.3，堿提pH11.8)，整個過程保證溫度低于10℃；pH值達到目的值后繼續攪拌提取蛋白質30min；4℃冷凍離心(5000×g，20min)，去掉沉淀；調上清液pH值到5.5，沉淀蛋白質；4℃冷凍離心(5000×g，20min)，下層沉淀即為酸堿法提取的鯽魚蛋白[7]。

1.3.1.3 煮制

鯽魚去刺取肌肉部分切片，清水洗凈。放入干凈玻璃器皿中，加蒸餾水在電磁爐上加熱至沸騰。取出放置室溫時絞碎備用。

1.3.1.4 腌制(濕腌)

鯽魚去刺取肌肉部分切片，清水洗凈，將其泡在質量分數15%的鹽溶液中。蓋上保鮮膜常溫條件下腌制6h，腌制好后絞碎備用。

1.3.2 樣品處理

準確稱取上述前處理魚各5.0g于50mL三角瓶中，加入10mL 80%甲醇，超聲5min(80W，20kHz)，將甲醇提取液轉入離心管中，8000r/min離心10min；如此重復提取3次，合并上清液，旋轉濃縮至約10mL，再8000r/min離心10min。取15mL甲醇加入ODS小柱內進行活化，用20mL超純水洗滌小柱，然后將離心樣品(1mL)轉ODS柱內緩慢通過，用10%甲醇2mL洗滌柱子，再用含有0.1%三氟醋酸的甲醇溶液2mL解吸，收集解吸溶液于50mL燒杯中并置75℃水浴中揮發甲醇溶液，用超純水洗滌燒杯后轉入1mL刻度具塞比色管內，調節pH值至中性。經0.45μm微孔濾膜過濾，供HPLC分析。

1.3.3 色譜條件

Crosmosile ODS色譜柱(250mm×4.6mm)；流動相A：0.01mol/L磷酸二氫鈉溶液；流動相B：乙腈；梯度洗脫程序：0.0～4.5min、30% B，4.5～5.0min、60% B，5.0～7.8min、70% B，7.8～10.0min、95% B，10.0～13min 30% B；檢測波長：λ1=238nm、λ2=355nm；流速1mL/min；

柱溫40℃。

1.3.4 標準品系列配置及樣品測定

分別配制質量濃度0.1、0.2、0.5、1.0、5.0μg/mL土霉素(用甲醇稀釋)和微囊藻毒素(用20%甲醇稀釋)標準品溶液?；旌蠘藴势吠撩顾?40μg/mL)與微囊藻毒素(0.2μg/mL)按4:1(m/m)配置，避光貯存。進樣量5μL，以色譜峰的峰面積(y)為縱坐標，與其對應的溶液質量濃度(ρ，μg/L)為橫坐標繪制標準曲線。同樣色譜條件對樣品進行檢測(進樣量20μL)。

2 結果與分析

2.1 方法和流動相的選擇

根據土霉素和微囊藻毒素的紫外吸光特性，設定吸光波長分別為土霉素238nm、微囊藻毒素355nm。最初選擇流動相A：超純水；流動相B：乙醇，洗脫程序為0.0～5.0min、10% B，5.0～10.5min、90% B，10.5～12.0min、10% B。土霉素出峰峰形良好，可是微囊藻毒素出峰基線不穩。調整方法時根據國標改變流動相為乙腈和0.01mol/L磷酸二氫鈉[8]，根據1.3.3節洗脫程序，兩種毒素各峰分離完全，且峰形良好，保留時間穩定，見圖1。

由圖2可知，在同樣色譜條件下，注入按1.3.4節配制好的混合標準品，在9.8min左右出現1個峰，在波長238nm處響應值很高，分析可能波長238nm比較低，很容易吸收微囊藻毒素標準品(純度95%)中的雜質。

2.2 方法的檢出限和線性范圍

按1.3.4節操作，回歸方程及相關系數分別為土霉素y1=1234.0ρ1＋1358.9，相關系數R2=0.9949；微囊藻毒素y2=35717ρ2＋11382，相關系數R2=0.9976；檢出限為土霉素0.1μg/kg、微囊藻毒素5.0ng/L。

2.3 精密度實驗

取質量濃度1.0μg/mL土霉素、微囊藻毒素標準品溶液，在上述色譜條件下，進行重復測定(n=6)，計算精密度。如表1所示，其相對標準偏差(RSD)分別為土霉素1.82%、微囊藻毒素1.68%。

2.4 回收率實驗

魚肉樣品進行土霉素和微囊藻毒素0.1、0.5、5.0μg/mL 3個水平分別測定在鯽魚肌肉中的回收率，結果見表2。

2.5 不同處理方法的比較

5種前處理方法中，水洗方法土霉素測定含量為142.4μg/kg，其余都超出國家標準含量(我國水產品土霉素最大殘留限量為200μg/kg)[9]。原因可能是處理時受到了水質污染。魚肉樣品中微囊藻毒素未檢出。

如圖3所示，在3min之前出峰可能是處理樣品摻入的雜質，與標準品對應沒有大的影響。

3 討?論

用酶聯免疫反應快速檢測試劑盒檢測提取出來的魚肉樣品，結果顯示水洗、酸洗、堿洗、煮制、腌制微囊藻毒素殘留量分別為1.26、1.04、2.64、0.35、0.31ng/L，由此可知不同處理方法，其殘留量不同。原因可能是不同處理方式，導致了魚肉蛋白變性，影響了毒素在固相萃取柱上的有效吸附從而導致回收率不同。由于殘留量少，在高效液相色譜中未能檢出，但在人體健康允許范圍內該研究方法具有實際意義。本方法根據國標方法進行改進，主要探究了在魚肉中有可能存在的兩種毒素，并建立了高效液相色譜方法，其結果能滿足淡水魚加工處理的分析要求，可運用在實際檢測中。

參考文獻：

[1] 秦峰, 陳國穎, 仇士林. 時間分辨熒光法高通量篩選魚肉組織中土霉素的殘留量[J]. 中國抗生素雜志, 2008, 33(9): 561-563.

[2] 龐國芳, 曹彥忠, 張進杰, 等. 高效液相色譜法同時測定禽肉中土霉素、四環素、金霉素、強力霉素殘留的研究[J]. 分析測試學報, 2005, 24(4): 61-63.

[3] 吳偉文, 楊左軍, 顧浩飛, 等. 固相微萃取/高效液相色譜法測定水中的微囊藻毒素[J]. 分析測試學報, 2007, 26(4): 545-547.

[4] 林瑤, 張瓊, 李一丹. 固相萃取-高效液相色譜法測定水中痕量微囊藻毒素[J]. 中國衛生檢驗雜志, 2010, 20(9): 2174-2175.

[5] 虞銳鵬, 陶冠軍, 貢小清, 等. 高效液相色譜-質譜聯用方法測定背角無齒蚌體內微囊藻毒素[J]. 分析測試學報, 2007, 26(5): 671-674.

[6] 徐立紅, 陳加平, 黃兆輝, 等. 用蛋白磷酸酶抑制法測定水體中的微囊藻毒素類物質[J]. 環境科學學報, 1999, 19(5): 536-539.

[7] HULTIN H O, KELLEHER S D. Process for isolating a protein composition from a muscle source and protein composition: US, 6288216 B1[P]. 2001-09-11. [2013-10-30 ]

[8] 遼寧省食品衛生監督檢驗所. GB/T5009.116—2003 畜禽肉中土霉素、四環素、金霉素殘留量的測定: 高效液相色譜法[S]. 北京: 中國標準出版社, 2003.

[9] CARIGNAN G, CARRIER K, SVED S. Assay of oxytetracycline residues in salmon muscle by liquid chromagraphy with ultra vialet detection[J]. Journal of AOAC International, 1993, 76(2): 325-328.