檢測細(xì)胞中1—磷酸鞘氨醇含量的LC—MS/MS分析方法的建立

蘭天　吳騰等

[摘要] 目的 建立并確證可以檢測1-磷酸鞘氨醇（S1P）快速、靈敏、特異的LC-MS/MS定量分析方法。 方法 采用C17-S1P作為內(nèi)參，甲醇一步法進(jìn)行蛋白沉淀，隨后進(jìn)行正相電噴霧離子化LC-MS/MS分析。流動相為甲醇-0.1%甲酸水（95∶5，v/v），流速0.2 mL/min，每個樣品的分析時間為4 min。細(xì)胞經(jīng)TNF-α處理后S1P含量顯著增加；而經(jīng)DMS處理后S1P含量顯著下降。 結(jié)果 S1P的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為0.1～10 ng/mL。相關(guān)系數(shù)r2均大于0.989。 結(jié)論 該方法可以快速，靈敏，特異性地同時檢測生物樣品中S1P的含量。

[關(guān)鍵詞]含量測定；1-磷酸鞘氨醇；液質(zhì)聯(lián)用

[中圖分類號] R743.3 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 2095-0616（2013）09-09-03

鞘磷脂不僅是細(xì)胞膜的主要成分，也可作為信號分子調(diào)控多種細(xì)胞進(jìn)程，包括細(xì)胞增殖，分化，存活，死亡以及一些細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[1-2]。幾種磷脂類代謝物，特別是鞘氨醇（Sph）和1-磷酸鞘氨醇（S1P）被認(rèn)為是具有顯著生物活性的關(guān)鍵分子，控制著細(xì)胞生存和死亡。S1P可以被S1P磷酸酶去磷酸化為Sph。Sph作為負(fù)性調(diào)節(jié)因子，抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)凋亡。相反，S1P作為Sph的磷酸化產(chǎn)物，參與了促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制凋亡過程[3]。目前已有一些方法用于測定生物樣品中低豐度的S1P含量。這些方法包括放射性同位素?fù)饺朊复俜磻?yīng)實驗[4]，放射性受體結(jié)合實驗[5]，HPLC柱前衍生化[6-7]，質(zhì)譜[8-9]以及LC-MS/MS等。

在本研究中，我們建立了一種快速，簡便，靈敏的LC-

MS/MS分析方法。本方法成功地測定了HEK293細(xì)胞中S1P的含量。

1 儀器與試藥

Finnigan TSQ Quantum三重四極桿質(zhì)譜儀（Thermo Electron，San Jose，CA，USA），色譜分析柱為Luna-RP C18色譜柱（150 mm L×2 mm i.d.，5 μm particle size and 100 ? pore size）；外加C18保護(hù)預(yù)柱（4.0 mm L ×2.0 mm i.d.）（Phenomenex，Torrance，CA，USA）。D-erythro-1-磷酸鞘氨醇（S1P），C17-d-erythro-1-磷酸鞘氨醇（C17-S1P）購自Avanti Polar Lipids（美國）。S1P和C17-S1P的貯存液[DMSO/濃鹽酸（100∶2，v/v）]配制，濃度均為100μg/mL。用甲醇配制并于-20℃保存。實驗時貯存液用甲醇進(jìn)一步稀釋成工作液。HPLC級甲醇和甲酸購自Tedia公司（美國）。其他所有有機溶劑和化學(xué)品均為分析純級。TNF-α購自BioSource（美國）；二甲基鞘氨醇（DMS）購自Biomol Research Laboratories公司（美國）；超純水由Milli-Q plus水純化設(shè)備提供（美國）。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件

溶劑及樣品經(jīng)Finnigan自動進(jìn)樣器和質(zhì)譜泵進(jìn)行分離。柱溫為25℃。流動相為甲醇-水（95∶5，v/v）（水中含0.1%甲酸）；流速為0.2 mL/min。每個樣品的分析時間為4 min。流動相調(diào)控色譜行為和恰當(dāng)?shù)碾x子化。為了摸索最優(yōu)流動相條件，我們研究了不同比例的甲醇，乙腈和水對實驗的影響。乙腈能夠降低樣品的分析時間，每個樣品可以在2 min內(nèi)分析完畢，但峰型比較寬，有一定的脫尾。而增加液相中甲醇的比例可以改善靈敏度和峰型，盡管分析時間長了一些。此外，加入少量甲酸可以提高靈敏度和改善峰型。最終，本實驗摸索的最優(yōu)流動相組成為：95%甲醇和5%甲酸水（甲酸水中含有0.1%的甲酸）。在該流動相條件下，每個樣品在4 min內(nèi)分析完成。

2.2 質(zhì)譜條件

2.3 細(xì)胞培養(yǎng)

人胚胎腎細(xì)胞293（HEK293）培養(yǎng)在含10%（v/v）胎牛血清，2 mM谷氨酰胺，0.2%（w/v）碳酸氫鈉，100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中。細(xì)胞于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞長至匯合狀時，采用0.25%胰酶進(jìn)行消化傳代。

2.4 樣品收集和制備

2.5 制備標(biāo)準(zhǔn)品

2.6 方法學(xué)考察

3 討論

S1P作為磷脂類小分子化合物，其在生物體內(nèi)的含量較低。最早人們采用放射自顯影技術(shù)進(jìn)行S1P含量測定。該實驗采用放射性標(biāo)記的底物[γ-32P]ATP進(jìn)行體外酶促反應(yīng)，隨后采用有機溶劑抽提和TLC分離，再用放射自顯影方法捕捉產(chǎn)物信號，最后采用液閃儀或磷屏掃描進(jìn)行定量分析[4]。另一種分析方法涉及到放射性受體競爭性結(jié)合實驗，該實驗通過[3H]S1P與未標(biāo)記的S1P競爭性與S1P1受體結(jié)合[5]。以上這些方法不僅費力耗時，而且難以區(qū)分結(jié)構(gòu)相似的化合物，例如S1P和DHS1P。因此，隨后人們使用HPLC作為一種替代方法來定量分析S1P以及相關(guān)化合物。使用HPLC時，Sph直接轉(zhuǎn)換成其熒光衍生物，而S1P則被堿性磷酸酶去磷酸化轉(zhuǎn)變成Sph，再進(jìn)行柱前衍生化。隨后，熒光衍生物經(jīng)HPLC分離后被熒光分光光度計檢測[5-6，12-17]。盡管HPLC方法避免使用到放射性試劑，但由于其樣品提取步驟繁瑣，且需要柱前衍生化，不適合大樣本分析。

質(zhì)譜技術(shù)是一類分析鞘磷脂代謝產(chǎn)物非常靈敏的分析方法，特別適合生物樣本中低豐度S1P的定量分析[18]。質(zhì)譜技術(shù)的成功應(yīng)用依賴于目標(biāo)物質(zhì)能否氣化，并且他們產(chǎn)生的離子可以被特異性地檢測出來。由于鞘磷脂類分子較容易離子化，而且所產(chǎn)生的碎片離子因其有特異的官能團(tuán)和骨架結(jié)構(gòu)而較容易鑒定區(qū)分[19]，因此磷脂類分子特別適合質(zhì)譜分析。近來有通過將樣品提取液直接注入質(zhì)譜儀中進(jìn)行分析的方法，該類方法較之HPLC更為簡便和靈敏[8]。不過，由于缺少色譜分離環(huán)節(jié)，該種方法需要多步提取來盡可能降低諸如等離子干擾以及基質(zhì)效應(yīng)的影響，這些因素反過來又使得這種方法存在費力耗時的缺點，限制其廣泛使用。LC-MS/MS技術(shù)是HPLC和MS技術(shù)的完美結(jié)合，具有更高的靈敏度，選擇性，特異性以及高通量等特點，特別適合大樣本分析。

本實驗建立并驗證了一種運用LC-MS/MS技術(shù)測量S1P含量的定量分析方法。該方法采用甲醇一步沉淀法提取，無需樣品氣化，采用非放射性標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)（C17-S1P）來檢測生物樣品中S1P的含量。流動相組分為甲醇和0.1%甲酸水（95∶5，v/v）。每個樣品的分析時間控制在4 min內(nèi)，可以滿足大樣本分析的要求。本方法將在研究S1P的生物學(xué)效應(yīng)以及相應(yīng)靶標(biāo)藥物的篩選方面得到廣泛應(yīng)用。

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（收稿日期：2013-04-23）