人胎盤來源Ⅳ型膠原蛋白的提取與純化

[摘要] 目的 從人胎盤中分離純化Ⅳ型膠原蛋白，為制備其抗體提供抗原。 方法 選擇人胎盤為提取原料，用胃蛋白酶消化、氯化鈉鹽析、凝膠化、超速離心、離子交換層析等方法，提取純化Ⅳ型膠原蛋白。采用SDS-PAGE對提取的Ⅳ型膠原蛋白進行鑒定。 結果 胃蛋白酶消化法，使獲得膠原蛋白的膠原鏈部分斷裂，凝膠化方法可預先分離出組織中的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原蛋白，保留了Ⅳ、Ⅴ膠原蛋白，DEAE-Sephrose 層析圖表明，層析柱吸附的蛋白經洗脫得一主峰，經SDS-PAGE 證實提取的Ⅳ型膠原蛋白的分子量80Kd和40Kd兩條帶。 結論 從人胎盤中提取的Ⅳ型膠原蛋白純度高，符合Ⅳ型膠原的特征。提取材料廣泛、實驗條件簡便，結果可靠。

[關鍵詞] Ⅳ型膠原蛋白；凝膠化；提取；純化

[中圖分類號] TQ464.7 [文獻標識碼] B [文章編號] 2095-0616（2013）19-56-02

Ⅳ型膠原（collagen type Ⅳ，Col Ⅳ）主要存在于各器官的基底膜中，是基底膜的微量成分[1]；是維持組織結構和調節細胞和細胞間相互作用的重要成分。近年來研究表明，許多增生性的疾病其Col Ⅳ含量與病變程度呈正相關；特別是在肝硬化診斷和分型方面，Col Ⅳ含量的檢測更為重要[2-4]。目前，國內由于缺乏Col Ⅳ純品，使其抗體制備受到限制，對其研究和檢測技術發展受到影響。

本研究旨在探討整合幾種Col Ⅳ的純化方法，建立以酶消化、超速離心、離子交換層析等技術聯合應用，從人胎盤中分離提純Col Ⅳ程序的可行性，為其抗體制備提供高品質抗原。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

LP型低壓層析系統（BIO-RAD）、AKTA prime plus蛋白分析儀（GE）、CP100WX超速離心機（HITACHI）、tff超濾濃縮儀（MILLIPORE）、DYY-8C電泳儀（北京六一儀器廠）。

1.2 主要試劑

胃蛋白酶（1∶80000，生工）、EDTA、胃蛋白酶抑制素、磺酰苯甲烷、N-馬來乙酰胺（優級純，生工）及相關轉印試劑等。

1.3 提純

選取新鮮正常分娩胎盤一個，置于-20℃冰箱內冷凍12h，粉碎機粉碎組織，采用含4mM EDTA，2mM氟化磺酰苯甲烷，10mM N-馬來乙酰亞胺，1μg/mL胃蛋白酶酶抑制素的蒸餾水制備勻漿，3000pm，5min離心，反復3次。用上述溶液洗滌24h，冷凍干燥。溶解干燥組織于0.5M HAC含有0.5mg/mL胃蛋白酶溶液中，4℃攪拌36h；100 000×g超速離心1h收集上清；上清于37℃保溫10h，10000×g離心；上清對1.5M Nacl/0.5M HAC透析，100 000×g超速離心取上清，沉淀溶于1.0M NaCl/0.05M Tris-HCl緩沖液中100 000×g超離1h，上清加NaCl至4.5M，100 000×g超離1h，沉淀溶解于0.1M HAC 100 000離心1h，沉淀溶解于0.1 M NaCl/0.05M Tris-Hcl緩沖液中，pH 7.4并透析100 000×g超離1h，收集上清。此上清為含有Col Ⅳ粗品。

DEAE-sepharose層析柱：取DEAE-sepharose 30mL，填裝于20×1.5層析柱內，預先使用5mM Tris-HCl緩沖液（pH 7.4）200mL平衡柱；將Col Ⅳ粗品經超濾濃縮至濃度為0.5mg/mL，取20mL應用于DEAE-sepharose柱，上樣速度為1mL/min，用Tris-HCl緩沖液洗柱，收集流出峰（1mL/管）。230mn監測吸收峰回復基線。用含0.1M Nacl上述緩沖液洗脫，收集洗脫峰（1mL/管）。分別超濾濃縮收集的液體至濃度為0.5mg/mL。

SDS-PAGE：分離膠8%（W/V），濃縮膠1%（w/v），樣品緩沖液（0.5mol/L Tris，3% SDS，10%甘油，0.01溴酚藍，pH6.8）。分別取流出峰和洗脫峰各20μL，加等量樣品緩沖液混勻，取20μL上樣，250V恒壓，電泳2h，考馬斯亮藍（250）染色。

2 結果

2.1 DEAE-sepharose柱層析

Ⅳ型膠原蛋白粗品，應用于離子交換柱，流出峰1和洗脫峰2（見圖1），流出峰較大，洗脫峰小，兩峰面積之比為1∶2 = 2.8∶1.6。

2.2 SDS-PAGE

峰1和峰2經SDS-PAGE電泳后，峰1主要條帶為120KD、90KD、30KD和低于20KD雜帶；峰2，主要2條帶80KD和40KD，少量低于40KD條帶。見圖2。

3 討論

膠原蛋白是由3條肽鏈（αl、α2、α3）呈螺旋形纏繞而成的繩索狀分子，人Ⅳ型膠原蛋白αl、α2鏈基因均定位于21q22.3位點，長度都為36kb，均由30個外顯子組成[5]。Ⅳ型膠原蛋白主要存在于組織器官相應結構的基底膜中，總體含量較低，故而在Ⅳ型膠原蛋白的提取，及其抗體制備方面有著一定的困難。

本研究選用人胎盤為提取原料，首先使用4種不同的蛋白酶抑制劑混合反復清洗，其目的在于去除組織中的血清成份，同時減少蛋白酶對膠原蛋白的分解作用[6]。

而后，采用膠原蛋白溶液在中性條件下置于37℃下保溫4～16h的凝膠化方法。通過該方法可使Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原發生凝膠化，而Ⅳ、Ⅴ型膠原仍可呈溶解狀態[7]。我們經過反復摸索，采用保溫10h后，經離心分離取上清，獲得含有Ⅳ、Ⅴ型膠原溶液。在這種分離過程中雖可能有部分Ⅳ、Ⅴ型膠原同時出現凝集，而使得目的膠原部分丟失，但卻可預先去除Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原，為進一步采用鹽抽提方法分離Ⅳ型膠原提供了方便，進而可獲取純度更高的Ⅳ型膠原。

離子交換層析方法可以進一步去除其他雜型膠原蛋白及非膠原成分，較好地提高膠原的純度[8]。本研究采用DEAE-Sephrose離子交換層析，進一步純化了樣品，層析圖中見單一洗脫峰，與永井裕等的報道一致。

SDS-PAGE廣泛應用于蛋白提純后成分的鑒定[9-11]。研究顯示，Ⅳ型膠原由分子量至少為40KD的兩種膠原鏈組成[12]。我們采用胃蛋白酶消化，使Ⅳ型膠原部分交聯鏈斷裂。SDS-PAGE結果可見40KD，80KD兩條蛋白帶，這與王榮春等[12]報道的結果相同。

綜上所述，采用上述方法可獲得純度較高的Ⅳ型膠原，從而為制備Ⅳ型膠原蛋白抗體提供了抗原，也為臨床抗體檢測方法的廣泛應用提供了借鑒。

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（收稿日期：2013-07-03）