嬰幼兒呼吸道合胞病毒性毛細支氣管炎血清ECPmRNA檢測臨床意義

詹 璐 邵征洋 王孫堯 林 隆 許先科 連俊蘭 李志敏 賀 悅

杭州市紅十字會醫院兒科 杭州 310003

嬰幼兒呼吸道合胞病毒性毛細支氣管炎血清ECPmRNA檢測臨床意義

詹 璐 邵征洋 王孫堯 林 隆 許先科 連俊蘭 李志敏 賀 悅

杭州市紅十字會醫院兒科 杭州 310003

毛細支氣管炎 兒童 呼吸道合胞病毒 嗜酸細胞趨化蛋白 ECP嗜酸性粒細胞陽離子蛋白（ECP）是嗜酸性粒細胞（Eos）釋放的毒性顆粒蛋白，ECPmRNA通過表達進一步釋放ECP，在炎癥性和過敏性疾病中均發揮著重要作用，但對ECPmRNA對在呼吸道合胞病毒（RSV）感染的毛細支氣管炎患兒中血清學含量變化研究較少[1-2]。本實驗通過測定呼吸道合胞病毒性毛細支氣管炎患兒血清ECPmRNA含量，探討其對呼吸道合胞病毒感染的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2009年6月—2011年3月本院兒科住院診治的毛細支氣管炎患兒63例，其中男35例，女28例，年齡（8.8±0.2）個月。病例納入標準：①初次發病。②診斷符合《諸福棠實用兒科學》第7版有關毛細支氣管炎診斷標準。③除外先天性心臟病、結核感染及支氣管異物等疾病。④經抗堿性磷酸酶橋酶標法（APAAP）檢測鼻咽部分泌物確診為RSV感染。⑤無個人和家庭過敏史（哮喘、過敏性皮炎、鼻炎）。⑥入院前2周未使用糖皮質激素。參照Bearman等[3]的毛細支氣管炎臨床癥候評分標準，將63例分為輕癥和重癥兩組。輕癥組（≤6分）19例，男11例，女8例，月齡3～24個月，平均（8.6±0.2）個月。重癥組（7～12分）44例，男24例，女20例，月齡4～24個月，平均（9.2±0.1）個月。另隨機選取同期體檢健康的嬰幼兒21名作為對照組，其中男10名，女11名，月齡4～24個月，平均（8.5±0.2）個月。對照組與感染組年齡、性別等差異均無統計學意義（P＞0.05）。本研究為成組設計臨床研究，實施前所有家長知情同意，并得到醫院倫理委員會批準。

1.2 方 法

1.2.1 儀器與試劑 儀器Bio-tek酶標儀。RNA提取盒購自上海華舜公司；RT-PCR一步法試劑盒購自美國Promega公司；PCR引物由上海太陽生物科技公司設計并合成。

1.2.2 標本收集與測定 對所有納入研究的患兒，在清晨空腹安靜狀態下采取靜脈血3mL，分離血清于無RNA酶EP管（干冰操作），置于-70℃冰箱中。RNA提取按試劑盒說明進行操作，目的基因ECP引物如下：上游：5′GAAAGATGGGGCTGTTGAGT3′，下游5′CTTCTCACCACGAGGTAGCG3′，擴增片段長度為135bp；內參基因β-肌動蛋白引物：上游5′ATTCCTATGTGGGCGAOGAG3′，下游5′AGAGGC?GTACAGGGATAGCA3′，擴增片段長度為284bp。按說明書提取細胞總RNA，反轉錄反應合成互補DNA（cDNA），以cDNA為模板進行PCR擴增。RT-PCR反應條件[4]如下：cDNA合成和預變性：50℃逆轉錄30min，94℃ 2min進行1次循環；PCR擴增: 95℃變性，1min，60℃退火1min，72℃延伸1min，共32個循環，最后以72℃延伸10min。取5μLPCR擴增產物于1.5%瓊脂糖凝膠中，120V電泳30min凝膠成像，應用圖像分析軟件分析各條帶平均灰度值，結果以目的基因與β-肌動蛋白CT比值表示。

2 結果

輕癥組、重癥組及對照組血清ECPmRNA表達量分別為0.4530±0.0562、0.5012±0.0373、0.3929± 0.0305；各毛支氣管炎患兒組血清ECPmRNA的表達量均明顯高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.01）；重癥組患兒血清ECPmRNA表達量高于輕癥組，差異有統計學意義（P＜0.01）。

感染組與對照組標本RT－PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖顯示：在大約135bp和284bp位置，各電泳道均出現擴增條帶，與ECP、β-actin預期擴增的目的條帶位置一致。ECP和β-aFtin相應于135bp和284bp位置。見圖1。

圖1 ECP mRNA電泳圖

3 討論

ECP是一種單鏈糖蛋白，呈強堿性，由嗜酸性粒細胞活化釋放，被認為是嗜酸性粒細胞的特異性標志。ECP反映了嗜酸性粒細胞的活化程度，具有強大的細胞毒性和神經毒性，可引起肥大細胞釋放組胺，是造成氣道炎癥、氣道高反應性、誘發和加重喘息的重要物質。毛細支氣管炎是嬰幼兒呼吸道感染的常見病，而RSV是毛細支氣管炎的主要病源，大約有80%的毛細支氣管炎由RSV[7]感染所致。流行病學調查發現，嬰幼兒期患過RSV毛細支氣管炎患兒50%～70%可反復喘息，甚至發展成哮喘[2-6]。因此RSV毛細支氣管炎與以后發展成反應性氣道疾病存在著密切關系。目前毛細支氣管炎后出現反復喘息發作以及毛細支氣管炎與哮喘之間的相關性已受到重視，通過采用候選基因的關聯分析法來尋求可能的RSV易感基因研究，獲得了大量天然免疫調節因子參與的證據[7]，其中很多研究就是關于ECP及嗜酸性粒細胞的。目前對于ECP與毛細支氣管炎關系研究較多，主要集中在對于毛細支氣管炎患兒鼻腔分泌物和血清液研究中，如Choi[8]及金可等[9]對毛細支氣管炎患兒急性期鼻咽腔分泌物進行研究，研究表明鼻咽中ECP濃度明顯升高，并且隨病情好轉而顯著降低。既往研究[1]，毛細支氣管炎患兒急性期血清中ECP濃度未見明顯升高，并且隨病情的好轉無明顯改變。但這兩種實驗對鼻部分泌物采樣要求高[9]，易受到污染。而血清ECP帶正電，呈弱堿性，不能通過血管內皮進入血循環或由血液進入氣道，因此其血清未見陽性。對于ECPmRNA目前研究較少，ECP通過ECPmRNA進行表達，故通過ECP mRNA測定可以了解ECP的含量及在病理過程中的作用。本研究證實，血清ECPmRNA參與毛細支氣管炎炎癥過程，與病情密切相關，說明毛細支氣管炎急性期有ECPmRNA分泌，嗜酸性粒細胞聚集并被激活，釋放出ECP導致氣道上皮細胞損傷，進而增加氣道的過敏性炎癥，引發喘息。

本組結果顯示，血清ECPmRNA在重癥毛細支氣管炎表達高于輕癥毛細支氣管炎，提示癥狀越重其ECPmRNA含量越高，而健康兒童表達最低。ECP mRNA由嗜酸性粒細胞分泌，其對毛細支氣管炎診治有重要的臨床意義。

［1］吳榮熙，王國健，李孟榮，等.ECP和IL-4、IL-5與RSV毛細支氣管炎發病機制相關性研究［J］.中國實用兒科雜志，2001，16（5）：284-285.

［2］邵莉，郭胤仕，朱麗君，等.支氣管哮喘患者血清IL-10、IL-5和ECP的變化及其意義［J］.免疫學雜志，2008，24（1）：76-77.

［3］Bearman JE，Tal A.Baviski C，et al.Dexamethasone and salbutamol in the treatment of actue wheezhing in infants［J］. Pediatrics，1983，71:13-18.

［4］Reed KL，Fruin AB，Bishop-Bartolomei KK，et al.Nenroki?nin-1 receptor and substance Pmessenger RNA levels in?crease during intraabdomial adhesion formation［J］.JSurg Res，2002，108（1）:165-172.

［5］陳小芳，樓永良，董琳，等.急性下呼吸道感染患兒呼吸道合胞病毒及其亞型的檢測及分析［J］.中國實用兒科雜志，2005，20（4）:205-208.

［6］Reijonen TM，Kotaniemi-Syrjane A，Korhonen K，et al.Predictors of asthma three years after hospital adimission for wheezing in infancy［J］.中國醫學科學學報，2004，26（3）: 298-301.

［7］Hull J，Thomson A，Kwiatkowski D.Association of respiratory syncytial virus bronchiolitis with the interleukin 8gene region in uk families［J］.Thorsx，2000，55（12）:1023-1027.

［8］Choi J，Callaway Z，Kim HB，etal.The role of TNF-alpha in eosinophilic inflammation associated with RSV bronchiolitis［J］.Pediatr Allergy Immunol，2010，21（3）:474-479.

［9］金可，張海鄰，陳小芳.呼吸道合胞病毒毛細支氣管患兒鼻咽分泌物中IL-5及嗜酸性粒細胞趨化蛋白檢測的臨床價值［J］.實用兒科雜志，2006，22:1749-1751.

2012-07-12