PCR－膜芯片檢測痰結核桿菌耐藥基因突變的應用研究

譚景尹，胡水秀，韋世錄，李翠萍，何 曉，何 敏＊，黃惠妮，鄭艷燕，周昌明

（1.南寧市衛生監督所，廣西 南寧530011；2.廣西龍潭醫院，廣西 柳州545005；3.廣西醫科大學醫學科學實驗中心，廣西 南寧530021；4.廣西醫科大學公共衛生學院，廣西 南寧530021；5.廣西疾病預防控制中心，廣西 南寧530021）

隨著聯合藥物的使用，結核分支桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）耐藥菌株的出現和傳播成為全球結核病疫情急劇惡化的主要原因。2006年在116個國家和地區250多萬的病人診斷為活動性肺結核，有12萬是耐藥結核病（Drug－resistant tuberculosis，DR－TB）［1］，已成為我國嚴重的公共衛生和社會問題。由于大量的臨床診斷病例因缺乏實驗室陽性結果而無法進一步的耐藥性檢測，結核病實驗室診斷和耐藥性檢測技術研究一直是國內外共同關注的焦點［2］。痰涂片、MTB培養加藥敏試驗仍是目前臨床廣泛采用鑒定MTB及其耐藥性的“金標準”，但對結核桿菌尤其是耐藥菌株的檢出率低，需時長，無法滿足臨床診斷與指導用藥的需要［3］。尋找簡便、靈敏、特異的方法，提高結核病臨床診斷的實驗室檢出率，并準確地檢測結核桿菌耐藥性，對耐藥結核病的早期診斷、有效化療和控制傳播極其重要。本課題組在前期研究中，以臨床分離株為對象利用反向點膜雜交（reverse dot blot hybridization，RDB）法構建了檢測耐藥結核桿菌的膜芯片及反應體系［4］并對其進行優化，明顯提高了結核桿菌的檢出率，將該技術直接應用于結核患者的痰樣本，一次性對六種一線抗結核藥物的耐藥基因突變進行檢測極大地縮短了檢測所需的時間。

1 材料與方法

1.1 標本來源 根據我國目前肺結核的診斷標準［5］，由廣西龍潭醫院提供的82例痰標本中，診斷為結核病的患者64例，痰涂片陽性14例，陰性50例；非結核病（其他呼吸系統疾病）18例。

1.2 主要試劑 蛋白酶K、Premix taq（美國Takala公司），結核桿菌IS6110基因的特異性引物和檢測探針（南寧中加免疫公司），多重PCR引物及寡核苷酸探針（上海生工公司合成并純化），尼龍膜（美國Pall公司），A液（2×SSC，0.1%SDS，pH7.4），B液（0.5×SSC，0.1%SDS，pH7.4），C液（0.1mol／L檸檬酸鈉，pH5.4），POD母液和TMB（深圳亞能生物公司）。

1.3 標本的處理 64例結核患者的痰標本均分為兩份，一份由龍潭醫院進行痰培養及藥敏試驗；另一份加入兩倍體積的4%NaOH溶液，行液化處理后，高溫高壓滅菌。吸打混勻，分裝至1.5ml的離心管，每管1ml。加入200μl消化緩沖液和20μl 20 mg／mL蛋白酶K，搖勻后56℃水浴3h，追加30μl蛋白酶K；消化過夜至痰液澄清透明。沸水浴10 min以滅活蛋白酶K。加入等體積的酚：氯仿：已戊醇混和液提取DNA。

1.4 TB膜芯片檢測結核桿菌IS6110基因 參照文獻［6］，膜芯片上結合3個專利檢測探針（專利200510019561.7）。

1.5 耐藥－TB膜芯片檢測結核桿菌耐藥基因突變12對特異性引物（專利200910114023.4）由上海生工合成并純化；以TB膜芯片檢測陽性的痰標本中結核桿菌DNA為模板進行多重PCR擴增，引物濃度10μM，模板DNA 5μl，總體積50μl分4管進行多重PCR擴增；反應程序為95℃預變性5min，94℃變性50s，60℃退火45s，72℃延伸50s，38個循環，最后72℃延伸5min。59個寡核苷酸探針（專利200910114023.4）由上海生工合成并純化；將點有探針的尼龍膜放入50ml離心管中，加入A液8－10ml，50℃預熱15min。同時PCR產物98℃變性10min，立即置于冰上5min。將已變性為單鏈的PCR產物加入帶有膜片的離心管中，置50℃雜交爐中雜交6h。同時另加40ml B液于新的離心管中50℃雜交爐預熱1h以上。將膜片移入已預熱的B液中洗5min，50℃輕搖。取POD母液5μl用A液按1∶2000稀釋，將膜片放入輕搖，孵育45 min。A液室溫洗膜5min，重復一次。C液室溫洗膜2min。新鮮配制顯色液，按19ml C液＋1ml TMB＋10μl 3%H2O2的順序加入。膜片放入顯色液避光顯色15min。以出現明顯藍紫色斑點為陽性結果。

1.6 DNA測序驗證 將結核桿菌耐藥基因PCR擴增陽性的標本送上海生工公司進行產物測序，測序結果與耐藥－TB膜芯片檢測的結果進行比較驗證。

1.7 統計分析 TB膜芯片與痰涂片檢測結核桿菌陽性率的結果比較采用SPSS13.0統計軟件進行卡方檢驗，以P＜0.01為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TB膜芯片與痰涂片結果比較 18例非結核患者的痰涂片檢測與TB膜芯片檢測特異度均為100%（18／18）；64例結核患者（包括確診及臨床診斷病例）痰涂片檢測的陽性率為21.9%（14／64），TB膜芯片檢測的陽性率為81.3% （52／64）。兩種方法檢測結核桿菌的陽性率差異有統計學意義（χ2＝36.03，P＜0.01），TB膜芯片檢測結核桿菌的陽性率明顯高于痰涂片檢查。此外，在痰涂片陰性的臨床診斷病例中，TB膜芯片對結核桿菌的檢出率為76.0%（38／50）（見表1）。82例痰標本中，痰涂片檢測的陽性預測值為100%（14／14），陰性預測值為26.5%（18／68）；TB膜芯片檢測的陽性預測值為100%（52／52），陰性預測值為60%（18／30）。TB膜芯片檢測結核桿菌可減少假陰性結果。

表1 TB膜芯片與痰涂片檢測痰標本中結核桿菌的結果

2.2 耐藥－TB膜芯片檢測結核桿菌耐藥基因突變的結果 耐藥－TB膜芯片檢測52例痰標本（TB膜芯片檢測陽性）中的結核桿菌耐藥基因，5例檢出耐藥基因突變，其中單INH基因突變的1例，單RFP基因突變的1例，INH和RFP基因同時突變的2例，INH、RFP和SM基因同時突變的1例。

2.3 耐藥－TB膜芯片與藥敏及DNA測序結果比較

64例結核患者的痰標本中，20例痰培養陽性的標本藥敏試驗檢出5例耐藥；將這5例標本的藥敏結果與耐藥－TB膜芯片的檢測及DNA測序結果進行比較發現：4例耐藥－TB膜芯片檢測結果與藥敏試驗及DNA測序結果基本符合（見表2），但由于膜芯片沒有設置相應gy95位點檢測探針，因此無法檢出相應gy95位點突變。此外，痰培養陰性的標本中耐藥－TB膜芯片檢測出1例存在INH的ka315位點突變，與DNA測序結果完全一致（見表2）。

表2 藥敏試驗結果與PCR－膜芯片及DNA測序結果的比較

3 討論

目前結核病患者感染原發性耐藥株的比例較高，并呈上升趨勢，對結核癥患者進行結核桿菌及其耐藥性的檢測是非常必要［7］。PCR－反向斑點雜交法應用DNA探針、核酸雜交、酶聯顯色3方面技術，同時檢測結核桿菌多個藥物的耐藥性［8］，是國內外研究的熱點。Morcillo等［9］應用該法檢測rpoB基因突變的靈敏度和特異度分別達到92.8%和100%；吳雪瓊等用該法同時檢測結核桿菌4種以上耐藥基因突變，與測序驗證完全相符［10］。由于上述研究均以單純結核桿菌培養菌株為標本，從中提取的DNA產量及純度相對較高，因此檢測結果顯示出較高的敏感性和特異性。但上述結果受臨床分離株的培養時間長，陽性率低的限制，因此，近幾年有學者以單一或3－5種抗結核藥物的耐藥基因為靶基因，直接利用該技術檢測痰標本耐藥基因的突變，得到部分結果與藥敏試驗及測序結果相符［11－13］。

本研究一次性檢測六種一線抗結核藥物耐藥基因突變，分兩大步驟實施。首先利用本課題組專利的TB膜芯片技術，通過結核桿菌IS6110基因確認痰標本中結核桿菌陽性，在特異度相同情況下，TB膜芯片法檢測結核桿菌的陽性率（81.3%）顯著高于痰涂片法（21.9%）（P＜0.01），特別在痰涂片陰性的結核患者中，TB膜芯片對結核桿菌的檢出率高達76.0%；而在陽性預測值相同的情況下，TB膜芯片法檢測結核桿菌的陰性預測值（60%）明顯高于痰涂片法（26.5%）。說明TB膜芯片法在直接檢測臨床標本中的結核桿菌方面具有較高的特異性和敏感性，可以為結核病的初篩及臨床診斷提供更方便快捷的檢測手段。第二步通過耐藥－TB膜芯片對52例結核桿菌陽性的痰標本，一次性進行異煙肼、利福平、鏈霉素、乙胺丁醇、比嗪酰胺、氟喹諾酮6種一線抗結核藥物的katG、inhA、oxyR－ahpC、rpoB、rpsL、rrs、embB、pncA、gyrA 9個耐藥基因的檢測，結果檢出5例耐藥基因突變，其中4例與藥敏和測序結果一致，由于膜片中探針的限制，部分突變類型分散在本檢測膜片覆蓋的序列之外，也有可能存在其他耐藥機制［14］，使得耐藥－TB膜芯片檢測的結果沒有完全與藥敏和測序結果一致。針對檢測受膜片設置探針限制這一缺點，可以根據研究的進展和實際需要隨時增添有關探針確保最大的檢出率［15］。此外，還有1例痰標本結核桿菌培養陰性，耐藥－TB膜芯片檢測與測序驗證結果均檢測出耐藥突變位點且完全相符，提示該病人可能存在異煙肼耐藥。

綜上所述，PCR－膜芯片技術具有簡便快捷、經濟安全、較高的特異性和敏感性等優點，并可以直接檢測出痰標本中未經培養的結核分支桿菌耐藥基因突變，48小時內即可提供檢測結果，從而彌補常規藥敏試驗的不足，為結核病臨床耐藥性的判定提供參考依據。但由于臨床標本的處理和靶DNA濃度對PCR擴增有直接影響［16］，因此標本DNA的提取方法還有待于繼續改進完善；同時由于檢測過程受到各種實驗因素和環境的影響，該法的穩定性和重復性也有待提高。

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