野鴉椿水提物對大鼠慢性肝纖維化的影響

劉迪棟 文旭 湯勇 張浩然 周常娥 高輝

肝纖維化是慢性肝病的共同病理學改變，也是各種慢性肝臟疾病向肝硬化發展的必經階段。近年研究表明，肝纖維化是一種可逆的病理階段，只要在肝纖維化階段進行合理治療，可以逆轉肝纖維化的進程，從而達到緩解甚至治愈。野鴉椿(Euscaphis Japonica)為省沽油科野鴉椿屬植物，是一種落葉小喬木，分布于我國的暖溫帶地區，果實主要含異懈皮苷、矢車菊素-3-木糖-葡萄糖苷、紫云英甙、山柰酚-3-葡萄糖苷及槲皮素-3-葡萄糖苷等。

湘西地區使用其果實治療肝炎、肝硬化歷史悠久，取得了一定的療效。目前，關于野鴉椿的肝纖維化保護作用尚未見報道。本實驗主要觀察野鴉椿對四氯化碳(CC14)所致大鼠慢性肝纖維化的肝保護作用，并初步探討其作用機制，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 材料與試劑 SD雄性大鼠 50 只，體重(150±10)g，由吉首大學動物中心提供。采集自湖南吉首地區的野鴉椿成熟果實，制成每毫升含生藥 4 g的水提物。秋水仙堿（昆明制藥有限公司，批號：070732）。CC14分析純（北京化工廠，批號：20080209）。透明質酸（批號：20090101）、層粘連蛋白（批號：20090108）、Ⅲ型前膠原蛋白肽（批號：20090105）放免試劑盒，均購自上海海研醫學生物技術有限公司。大鼠轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)ELISA試劑盒（武漢博士德公司）。

1.2 儀器與設備 TGL-16 G低溫高速離心機（上海醫用分析儀器廠），GC-911 型γ放射免疫計數器（中國科技大學科技實業總公司），EL301 型酶標儀（BIO-TEK公司，美國）。

1.3 方法

1.3.1 動物模型建立及藥物處理 將實驗大鼠隨機分成 5 組，每組 10 只，即正常組、模型組、秋水仙堿組以及野鴉椿高、低劑量組。參考文獻[1-2]造成大鼠肝纖維化模型，各組動物均飲用 350 mg/L苯巴比妥溶液兩周，隨后模型組及各給藥組灌胃給予CCl4-橄欖油溶液（CCl4與橄欖油的容積比為 1∶1），首次每只大鼠給 0.08 mL，以后按 2 mL/kg給予，2 次/周，每周稱重 1 次，調整劑量，總計給CCl4-橄欖油溶液 8 周。正常組給等體積橄欖油。

從給CCl4-橄欖油溶液第 4 周開始給藥，秋水仙堿組給秋水仙堿 0.1 mg/kg，野鴉椿高、低劑量組分別給野鴉椿水提物 1 mL/kg和 0.2 mL/kg，以上藥物使用時均用生理鹽水稀釋成 2 mL灌胃給藥，連續 5 周，模型組及對照組給等體積生理鹽水。

1.3.2 指標檢測 給藥結束后各組大鼠腹主動脈取血，離心取血清檢查各項指標。放免法檢查血清HA、LN、PⅢP，TGF-β1及TNF-α采用ELISA方法檢查；肝組織病例采用HE染色方法。

1.4 統計學方法 所有數據采用SPSS12.0 統計學軟件進行處理，結果以均數±標準差（±s）表示，實驗數據采用方差分析，組建比較用q檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 野鴉椿水提物對肝纖維化大鼠血清指標的影響 模型組大鼠血清HA、LN及PⅢP濃度顯著高于正常組，野鴉椿高、低劑量組均明顯低于模型組；野鴉椿高劑量組HA、LN濃度與秋水仙堿組沒有顯著性差異，PⅢP則高于秋水仙堿組，而低劑量組HA、LN及PⅢP均高于秋水仙堿組；組間比較野鴉椿高劑量組HA、LN及PⅢP均顯著低于低劑量組(見表1)。

表1 野鴉椿水提物對肝纖維化大鼠血清HA、LN及PⅢP的影響(±s，n=10)

表1 野鴉椿水提物對肝纖維化大鼠血清HA、LN及PⅢP的影響(±s，n=10)

注：b與正常組比較P＜0.01，c與正常組比較P＜0.01；f與模型組比較P＜0.01；h與秋水仙堿組比較P＜0.05；i與秋水仙堿組比較P＜0.01；l與野鴉椿低劑量組比較P＜0.01

組別 HA(μg/L) LN(μg/L) PⅢP(μg/L)正常組 84.2±12.86 23.49±4.93 17.43±2.16模型組 330.36±47.07 c 49.76±8.54 c 39.82±4.35 c秋水仙堿組 164.94±23.55 26.28±5.14 21.61±3.37野鴉椿低劑量組 185.35±28.15 cfi 42.35±7.93 cfi 32.01±4.18 cfi野鴉椿高劑量組 161.66±22.53 cfl 28.29±5.65 bfl 25.93±3.63 cfhl

2.2 野鴉椿水提物對肝纖維化大鼠血清TGF-β1及TNF-α的影響 模型組大鼠血清TGF-β1及濃度顯著高于正常組，野鴉椿高、低劑量組兩者濃度明顯低于模型組；野鴉椿高劑量組TGF-β1濃度與秋水仙堿組沒有顯著性差異，而低劑量組則高于秋水仙堿組，野鴉椿高劑量組則顯著低于低劑量組；野鴉椿高、低劑量組TNF-α濃度均高于秋水仙堿組，野鴉椿高劑量組則顯著低于低劑量組(見表2)。

表2 野鴉椿水提物對大鼠血清TGF-β1 及TNF-α的影響(±s，n=10)

表2 野鴉椿水提物對大鼠血清TGF-β1 及TNF-α的影響(±s，n=10)

注：c與正常組比較P＜0.01；f與模型組比較P＜0.01；h與秋水仙堿組比較P＜0.05；i與秋水仙堿組比較P＜0.01；l與野鴉椿低劑量組比較P＜0.01

組別 TGF-β1(pg/L) TNF-α(μg/L)正常組 15.47±4.64 30.69±6.66模型組 39.43±10.32 c 199.53±32.84 c秋水仙堿組 18.23±7.53 77.79±18.65野鴉椿低劑量組 28.68±9.61 cfi 122.62±25.82 cfi野鴉椿高劑量組 20.57±7.17 cfl 85.81±18.49 cfhl

3 討論

HA、LN、PⅢP是反映肝纖維化較為敏感和特異的指標，3 項聯用更為客觀、可靠，并可反應肝纖維化的不同階段[3]。野鴉椿水提物高、低劑量組均可顯著降低大鼠血清HA、LN、PⅢP的水平，且高劑量組三者水平均低于低劑量組，顯示出一定的劑量依賴性。病理切片也顯示野鴉椿水提物高、低劑量組肝細胞的炎癥水腫、膠原纖維沉積等情況要好于模型組，這些都說明野鴉椿水提物具有良好的抗肝纖維化作用。其抗肝纖維化的作用可能與抑制TGF-β1及TNF-α表達有關。

TGF-β1是目前己知的重要致肝纖維化的細胞因子之一[4-6]。在肝臟中TGF-β1來源于竇內皮細胞、Kupffer細胞及肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)。TGF-β1在肝纖維化的起始和持續發展中起關鍵作用，能夠促進HSC的增殖和活化[7]，促進細胞外基質(extracellular matrix，ECM)的合成并抑制其降解[8-10]，能預示肝炎病情的進展，并可反映肝纖維化的程度。激活的HSC又可分泌TGF-β1[9]，導致惡性循環，使肝纖維化不斷進展。野鴉椿水提物高、低劑量組均可顯著降低大鼠血清TGF-β1的水平，從而抑制HSC等細胞的激活，使HSC合成ECM減少，并且也可能由于TGF-β1的減少而促進HSC等的凋亡，阻斷肝纖維化的進程，而抑制TGF-β1的作用及促進HSC的凋亡是肝纖維化及肝硬化治療的重要途徑之一[11-12]。

TNF-α主要由單核巨噬細胞、HSC及Kupffer細胞等產生，對肝纖維化的啟動及調控起重要作用[13-14]。不僅是重要的炎癥介質，還可促進肝內纖維母細胞增殖、膠原合成[15]，更重要的是可促進HSC的活化、增殖和分泌ECM，同時也能促使活化的HSC自分泌多種細胞因子，如白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、IL-1、表皮生長因子(Epidermal Growth Factor，EGF)、內皮素-1(endothelin-1，ET-1)、TGF等，還與其他細胞因子如TGF-β、血小板源生長因子(platelet-derived growth factor，PDGF)、IL-1 等形成調節網絡，共同導致肝纖維化[16-17]。而野鴉椿水提物高、低劑量組均可顯著抑制大鼠血清TNF-α的升高，從而抑制炎癥反應，抑制纖維母細胞的增殖，減少膠原纖維合成，抑制HSC的激活，使HSC合成ECM及TGF-β、PDGF、IL-1 減少，阻斷肝纖維化的進程。野鴉椿水提物可使肝纖維化大鼠TGF-β1及TNF-α均降低，不但可使兩者各自致肝纖維化作用得到抑制，更減少了兩者致肝纖維化的協同作用，阻斷肝纖維化形成的調節網絡。

[1]徐淑云，卞如濂.藥理實驗方法學[M].3 版.北京：人民衛生出版杜，2005：1350-1351.

[2]Ramirez FC,Hakim S,Tharalson EM,et al.Feasibility and safety of string wireless capsule endos copy in the diagnosis of esophageal varices[J].Am J Gastroenterol,2005,100(5):1065-1071.

[3]C Rinaldi A Lesmana,Irsan Hasan,Unggul Budihusodo,et al.Diagnostic value of a group of biochemical markers of liver fibrosis in patients with nonalcoholic steatohepatitis[J].Journal of Digestive Diseases,2009,10:201-206.

[4]Seki E,De Minicis S,Osterreicher CH,et al.TLR4 enhances TGFbeta signaling and hepatic fibrosis[J].Nat Med,2007,13:1324-1332.

[5]Inagaki Y,Okazaki I.Emerging insights into transforming growth factor beta Smad signal in hepatic fibrogenesis[J].Gut,2007,56:284-292.

[6]Breitkopf K,Godoy P,Ciuclan L,et al.TGF-beta/Smad signaling in the injured liver[J].Z Gastroenterol,2006,44:57-66.

[7]Kitamura Y,Ninomiya H.Smad expression of hepatic stellate cells in liver cirrhosis in vivo and hepatic stellate cell line in vitro[J].Pathol Int,2003,53(1):18-26.

[8]Schnur J,Oláh J,Szepesi A,et al.Thioacetamide-induced hepatic fibrosis in transforming growth factor beta-1 transgenic mice[J].Eur J Gastroenterol Hepatol,2004,16:127-133.

[9]Gressner AM,Weiskirchen R.Modern pathogenetic concepts of liver fibrosis suggest stellate cells and TGF-beta as major players and therapeutic targets[J].J Cell Mol Med,2006,10:76-99.

[10]Parsons CJ,Takashima M,Rippe RA.Molecular mechanisms of hepatic fibrogenesis[J].J Gastroenterol Hepatol,2007,22(Suppl 1):S79-S84

[11]Gressner OA,Lahme B,Demirci I,et al.Differential effects of TGFbeta on connective tissue growth factor(CTGF/CCN2)expression in hepatic stellate cells and hepatocytes[J].J Hepatol,2007,47:699-710.

[12]Gressner AM,Weiskirchen R.Modern pathogenetic concepts of liver fibrosis suggest stellate cells and TGF-beta as major players and therapeutic targets[J].J Cell Mol Med,2006,10(1):76-99.

[13]姜慧卿，趙東強.腫瘤壞死因子-α對肝星狀細胞增殖與凋亡的影響[J].中國病理生理雜志，2003，19(10)：1353-1356.

[14]陳偉鋒，汪謙.細胞因子網絡與肝纖維化[J].臨床床外科雜志，2005，13(7)：456-458.

[15]Thalheimer U,Triantos CK,Samonakis DN,et al.Infection, coagulation,and variceal bleeding in cirrhosis[J].Gut,2005,54(4):556-563.

[16]Faouzi S,Lepreux S,Bedin C,et al.Activation of cultured rat hepatic stellate cells by tumoral hepatocytes[J].Lab Invest,1999,79(4):485-493.

[17]Maher JJ,Lozier JS,Scott MK.Rat hepatic stellate cells produce cytokine-induced neutrophil chemoattractant in culture and in vivo[J].Am J Physiol,1998,275(4):G847-G853.