翻白草油對RSV感染宿主HeLa細胞Bcl-2蛋白和Bax蛋白表達的影響

劉 蕾 陳 光 王躍新 王淑秋 張鵬霞 王柏欣 王 薇

(佳木斯大學基礎醫學院，黑龍江 佳木斯 154007)

呼吸道合胞病毒(RVS)是一群分布十分廣泛的RNA病毒，可以感染呼吸道、心肌等，并造成流行性傳播〔1～3〕。翻白草(Potentilla discolor Bunge)，又名雞腿兒、雞腳草、天青地白、白頭翁、葉下白，為薔薇科委陵菜屬植物翻白草的全草，具有解毒、清熱、止血消腫和止痢的作用，可治療痢疾、瘧疾、肺癰、癤癰、咯血、崩漏、瘡癬。現代醫學研究其具有降低血糖、抗病毒、抗菌和降低血脂〔4～6〕等豐富的藥理作用，且毒副作用低。

1 材料與方法

1.1 材料 HeLa細胞株和RSV病毒株由佳木斯大學病理生理學教研室保存。翻白草油由本實驗室提取，血清、RPMI1640培養液、雙抗(青霉素-鏈霉素)均購自美國GIBCO公司;β-actin、兔源Bcl-2多克隆抗體、兔源Bax和辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗兔IgG抗體購自美國Santa公司;脫脂奶粉購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 HeLa細胞株在10%RPMI1640細胞培養液(10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素)，37℃，5%CO2培養，約80%以上融合時取0.25%胰蛋白酶－0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)消化，傳代。

1.2.2 藥物配制 用細胞維持液(含2%胎牛血清)將翻白草油(65.6 mg/ml)按1∶20、1∶40等比例進行2倍倍比稀釋，0.22μm濾器抽濾除菌，4℃條件下保存。

1.2.3 病毒毒力測定 病毒毒力用50%細胞感染量(CCID50)表示。將 RSV液從10－1～10－10做10倍系列稀釋。將各稀釋度的RSV液接種HeLa細胞，設陰性對照，且每一稀釋度設8個復孔，培養3～5 d，觀察和記錄細胞病變(CPE)。CCID50用Reed-Muench法求出。

1.2.4 翻白草油對HeLa細胞毒性測定 將不同濃度的翻白草油分別加入HeLa細胞已長成單層的96孔細胞培養板中，每個濃度重復8個復孔，同時設立正常細胞對照，置于37℃、5%CO2培養箱內培養，連續觀察3 d，記錄細胞形態變化。培養結束前4 h，吸棄培養板中液體，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，每孔加入MTT(5 mg/ml)20μl，于37℃培養箱中培養4 h，去上清后每孔加DMSO 200μl，微量振蕩器振蕩5 min，酶標讀數儀比色(波長490 nm)測吸光度值。實驗重復3次。

1.2.5 翻白草油抗RSV的作用方式 每一濃度設4個培養瓶，實驗同時設病毒對照。(1)藥物配制:用2%RPMI1640維持液(含2%胎牛血清)將翻白草油進行稀釋濃度為0.1、0.025、0.006 3 mg/ml，0.22 μm 微孔濾器抽濾除菌，4℃ 保存備用。(2)100 CCID50RSV病毒液配制:用2%RPMI1640維持液將RSV病毒原液1 000倍稀釋，0.22μm微孔濾器抽濾除菌，4℃保存備用。(3)對RSV的直接滅活作用:不同濃度的翻白草油分別與100 CCID50RSV液等量混合，37℃作用2 h后，將其接種HeLa細胞，37℃吸附2 h后，棄上清，加5 ml維持液。(4)在生物合成階段對RSV的作用:在長成單層Hela細胞上，接種0.5 ml的100 CCID50RSV病毒病毒液，37℃吸附2 h，棄病毒液，加入不同濃度的翻白草油5 ml。不同濃度的翻白草油分別與100 CCID50RSV液等量混合，立即加入HeLa細胞中，37℃，吸附2 h后，棄培養瓶液體，加入維持液5 ml。(6)藥物對細胞預處理作用:預先加入不同濃度的翻白草油5 ml于HeLa細胞，37℃條件下，作用4 h后，PBS洗3次后，加入100 CCID50RSV液0.5 ml，37℃條件下，吸附2 h，棄RSV液上清，加入細胞維持液5 ml。

1.2.6 Western印跡檢測Bcl-2蛋白和Bax蛋白的影響 裂解細胞樣品，測定蛋白含量，100℃、5 min蛋白變性，經100 V、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離后，260 mA電轉移到聚偏二氯乙烯(PVDF)膜，Tris鹽酸緩沖液(TBST)緩沖液漂洗。5%脫脂奶粉37℃封閉1 h，TBST漂洗，Bcl-2蛋白或Bax蛋白兔源多克隆抗體4℃過夜孵育，TBST漂洗，HRP標記二抗37℃，90 min，TBST漂洗。增強化學發光法(ECL)顯色試劑顯色，對照Marker記錄實驗結果。將結果進行拍照，用凝膠圖像處理系統分析目標條帶的凈光密度值。

1.3 統計學方法 應用SPSS統計軟件進行分析，方差分析調用Proc GLM過程，組間比較采用Dunnet t檢驗。

2 結果

2.1 RSV毒力測定 用普通光學倒置顯微鏡觀察CPE，與HeLa細胞對照組相比，RSV作用的HeLa細胞收縮變圓，典型串珠樣改變。72 h后，CPE陽性細胞為50%HeLa細胞出現病變;CPE陰性細胞未出現細胞病變。通過Reed-Muench法計算RSV液對HeLa細胞的毒力為105.8CCID50/L，本實驗病毒攻擊量為103CCID50/L。

2.2 翻白草油對宿主Hela細胞毒性作用 翻白草油對宿主HeLa細胞毒性作用表現為細胞增殖緩慢、細胞皺縮變圓、顆粒增多、折光性增強、部分細胞出現破碎脫落等，HeLa細胞活力隨著翻白草油濃度的降低，逐漸增加，翻白草油的最小毒性濃度是0.10 mg/L。見圖1。

2.3 Western印跡檢測翻白草油對RSV感染宿主HeLa細胞Bax蛋白和Bcl-2蛋白的影響 翻白草油(除翻白草油預處理作用方式)組與病毒組比較，宿主HeLa細胞Bax蛋白的表達明顯降低(P＜0.05)，而Bcl-2蛋白的表達明顯增加(P＜0.05)。見圖2。

3 討論

植物揮發油的主要成分是倍半萜烯、萜烯、酯和醇等。研究發現，其具有抗癌、抗菌和抗病毒等多種藥理作用〔7〕，因此，植物揮發油的研究日益受到人們的重視。翻白草油是傳統中藥翻白草的揮發油，是傳統中藥，性味苦，平。翻白草應用歷史悠久，《本草綱目》和《救荒本草》等醫藥典籍記載，功用主要為治痢疾、瘡疥、祛風濕和解毒等。現代藥理學研究證實翻白草具有降低血糖、血脂和抗病毒、抗菌等多種藥理作用。但抗RVS作用的研究較少。

細胞凋亡是生命的基本特征之一，一種由基因調控的而使細胞主動有序的死亡過程，是機體生長發育、細胞分化、生理及病理性死亡的重要機制。細胞凋亡與細胞增殖共同維持機體正常生長發育和內環境穩定。細胞增殖與凋亡失控導致許多疾病的發生。凋亡一般由細胞外的調節因素與其在細胞表面的受體結合而啟動。

Bax/Bcl-2系統介導的細胞凋亡途徑是目前研究較為深入的有關細胞凋亡的信號傳導。細胞凋亡的發生和發展取決于促凋亡與抑凋亡成員間的相對濃度，Bax和Bc1-2是Bcl-2癌基因家族中功能相反的兩個重要成員，分別為促凋亡類蛋白抗凋亡類蛋白，Bcl-2/Bax比值決定細胞是否進入內源性凋亡途徑，當Bax占優勢時，細胞進入線粒體依賴的內源性凋亡途徑，反之，則不能進入〔8〕。Bax在正常細胞中主要分布在細胞質，在凋亡刺激因子的作用下，可以發生轉位與線粒體相互作用，破壞線粒體膜的完整性，使線粒體內某些促凋亡分子外流，進而活化基質金屬蛋白酶(caspase-9)，激活caspases-3分子，啟動細胞凋亡過程〔9〕。Bc1-2在線粒體外膜和 bax結合形成異構二聚體阻止bax對線粒體的損傷，以維持線粒體膜的完整性，抑制細胞凋亡Bax/Bcl-2系統介導的細胞凋亡〔10〕。病毒感染與宿主細胞凋亡有著密切的聯系，病毒感染宿主細胞后，通過各種機制參與宿主細胞凋亡的誘導〔11，12〕，

本研究結果提示RSV可能通過抑制凋亡抑制基因 Bcl-2的表達，增加凋亡促進基因Bax的表達，導致caspase-3被激活，通過內源性(線粒體途徑)誘導Hela細胞凋亡。另外，在三種作用方式下翻白草油抗RSV作用可能與抑制RSV引起的宿主細胞凋亡有關。翻白草油抗RSV病毒中線粒體途徑起主要作用，但對于該過程具體的調控機制、相關的分子機制以及是否涉及其他信號分子，可能還有其他途徑參與，還需做進一步的實驗研究。

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