反復(fù)流產(chǎn)患者血清MMP-9和TIMP-1的表達(dá)

林 琳 柳愛(ài)華 陳惠琴 陳晶兒 鄧志敏

1.廣東醫(yī)學(xué)院附屬南山醫(yī)院婦科，廣東深圳 518053；2.廣東省深圳市寶安區(qū)人民醫(yī)院婦科，廣東深圳 518101

基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是參與細(xì)胞外基質(zhì)降解和重塑正常組織的重要酶類(lèi)，正常情況下MMPs和其組織抑制物（TIMPs）維持著一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡，該平衡對(duì)妊娠建立極為關(guān)鍵[1]。本研究通過(guò)對(duì)反復(fù)自然流產(chǎn)患者（實(shí)驗(yàn)組）和正常早孕需終止妊娠者 （對(duì)照組）血清基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）和其抑制劑（TIMP-1）水平進(jìn)行檢測(cè)和臨床應(yīng)用價(jià)值評(píng)價(jià)，以探討其與相應(yīng)指標(biāo)表達(dá)的關(guān)系，從分子水平研究反復(fù)自然流產(chǎn)患者的發(fā)病相關(guān)因素。

1 材料與方法

1.1 材料

收集 2010年7月～2012年3月深圳市寶安區(qū)人民醫(yī)院婦產(chǎn)門(mén)診，其中反復(fù)自然流產(chǎn)（實(shí)驗(yàn)組）血清30份；采集正常早孕需終止妊娠者（對(duì)照組）血清30份，上述病例均符合下列條件：孕周＜12周；無(wú)其他急、慢性病史。排除以下因素：①染色體異常；②內(nèi)分泌異常；③子宮畸形；④血栓形成傾向；⑤免疫因素；⑥感染因素。對(duì)照組：選擇同期就診要求行人工流產(chǎn)患者30例。妊娠周數(shù)均≤8周，患者無(wú)慢性高血壓、肝腎及血液系統(tǒng)疾病及急性炎癥。兩組研究對(duì)象年齡、健康狀況差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），具有可比性。所有患者均用肝素抗凝管空腹取靜脈血，分離血漿，測(cè)MMP-9及TIMP-1的含量。

1.2 試劑

采集患者入院后第2天的空腹靜脈血3 mL，4 000 r/min離心5 min后吸取血清，-75℃下保存?zhèn)錅y(cè)。人血清MMP-9和TIMP-1定量酶聯(lián)檢測(cè)試劑盒 （美國(guó)Biosourc公司），酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）檢測(cè)：按雙抗體夾心ABC2 ELISA法試劑說(shuō)明操作，對(duì)標(biāo)本和試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行一次性檢測(cè)。

1.3 雙抗體夾心ABC2 ELISA法檢測(cè)：

采用0.05MPH9碳酸鹽包被抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1～10μg/mL。每個(gè)反應(yīng)孔添加0.1 mL，4℃過(guò)夜。次日去掉孔內(nèi)溶液并洗滌3次，每次3 min。加標(biāo)本樣品0.1 mL于反應(yīng)孔中，置37℃下孵育1 h。然后洗滌。于反應(yīng)孔中加酶標(biāo)抗體0.1 mL，37℃孵育0.5～1.0 h，洗滌。最后加TMB底物 0.1 mL，37℃下 10～30 min。

1.4 評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[2]

于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽(yáng)性程度越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無(wú)色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號(hào)表示。 也可測(cè)OD值：在ELISA檢測(cè)儀上，于450 nm（若以ABTS顯色，則 410 nm）處，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔OD值，若大于規(guī)定的陰性對(duì)照OD值的2.1倍，即為陽(yáng)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 15.0軟件包進(jìn)行處理，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

反復(fù)自然流產(chǎn)患者（實(shí)驗(yàn)組）血清30份，正常早孕需終止妊娠者血清30份，測(cè)MMP-9和TIMP-1水平：在正常早孕的血清中MMP-9含量均明顯高于反復(fù)自然流產(chǎn)者，在正常早孕的血清中TIMP-1的含量低于反復(fù)自然流產(chǎn)者，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。見(jiàn)表1。

表1 兩組患者血清MMP-9和TIMP-1水平比較（x±s，ng/mL）

3 討論

反復(fù)自然流產(chǎn)是指連續(xù)發(fā)生2次或2次以上的自然流產(chǎn)，病因十分復(fù)雜，確切機(jī)制尚不明確，可能是多因素共同作用的結(jié)果，目前所了解的病因主要包括、遺傳、內(nèi)分泌、感染、免疫等因素[3]。MMPs家族是一類(lèi)活性依賴(lài)于鋅離子和鈣離子的蛋白水解酶，主要的生理作用是降解細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）[4]。MMPs由 5 個(gè)結(jié)構(gòu)域（除 MMP-7 外）組成：信號(hào)肽域、前肽域、催化域、鉸鏈區(qū)、血紅素結(jié)合蛋白樣或纖維結(jié)合素樣的COOH末端域。MMPs在生理狀態(tài)下參與胚胎形成，并與一系列妊娠疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)[5-6]。MMP-9在排卵前后表達(dá)最強(qiáng)，在著床期前后分泌入腺腔和宮腔液中，與胚胎識(shí)別有關(guān)[7-8]。

本實(shí)驗(yàn)選取的病例數(shù)據(jù)顯示，在正常早孕的血清中MMP-9的含量均明顯高于反復(fù)自然流產(chǎn)者，在正常早孕的血清中TIMP-1的含量低于反復(fù)自然流產(chǎn)者，筆者查閱和收集了大量有關(guān)MMPs及TIMPs與反復(fù)流產(chǎn)的相關(guān)性的國(guó)內(nèi)外研究的最新文獻(xiàn)，初步闡明正常早孕者絨毛組織的侵襲力強(qiáng)于反復(fù)自然流產(chǎn)者[9-10]；TIMP-1含量在正常早孕組中明顯低于反復(fù)自然流產(chǎn)組，表明在反復(fù)自然流產(chǎn)者中絨毛侵襲力相對(duì)較弱，可能與反復(fù)自然流產(chǎn)的發(fā)生相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)?zāi)壳安±芯砍醪奖砻鳎琓IMP-1含量較多可顯著減少M(fèi)MP-9活化及侵襲能力，二者之間可能呈負(fù)相關(guān)。據(jù)此，筆者推測(cè)，TIMP-1可能通過(guò)抑制明膠酶活化，從而抑制滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲能力，參與早孕滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)調(diào)控。

反復(fù)自然流產(chǎn)機(jī)制尚不明確。而反復(fù)自然流產(chǎn)是婦產(chǎn)科常見(jiàn)病、多發(fā)病，嚴(yán)重影響婦女精神健康，給家庭和諧帶來(lái)不同程度影響并產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)壓力。因此，探討反復(fù)流產(chǎn)患者是否存在MMPs和（或）TIMPs的表達(dá)異常，針對(duì)性預(yù)防和治療，能夠?yàn)椴辉谢颊呋蜉o助生殖技術(shù)的研究提供新思路。本研究因關(guān)注點(diǎn)的特殊性，從分子水平為進(jìn)一步明確反復(fù)自然流產(chǎn)發(fā)病原因提供有力證據(jù)。

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