腫瘤壞死因子基因多態性與非小細胞肺癌易感性的相關性研究

郭宇玲，陳 麗，劉 佳，孫 哲

（南昌大學第一附屬醫院腫瘤科，南昌 330006）

原發性肺癌（簡稱肺癌）是嚴重威脅人類生命的惡性腫瘤之一。 肺癌的發生是一個多因素、多步驟的過程，除環境因素外，個體的遺傳易感性因素也是導致肺癌發生的重要原因。流行病學研究［1-2］表明，肺癌具有家族聚集現象，目前家族的遺傳易感性所起的作用逐漸為人們所重視。 腫瘤壞死因子-α（TNF-α）位于6 號染色體短臂Ⅲ類MHC 區域，其啟動子區域存在多種等位基因多態現象，TNF-α 基因多態現象與血清TNF-α 表達水平密切相關，并與某些腫瘤的易感性有關。 有資料顯示，TNF-α 基因多態性可能與肺癌的易感性有關，非小細胞肺癌約占肺癌點數的80%［3-4］。本研究旨在探討腫瘤壞死因子基因多態性與非小細胞肺癌易感性的關系。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇2007 年1 月至2012 年1 月南昌大學第一附屬醫院腫瘤科收治的非小細胞肺癌患者60 例（肺癌組），均符合病理學診斷。 其中男38例，女22例，年齡38～82 歲，平均51 歲；鱗癌38 例，腺癌22例。 臨床分期：Ⅰ+Ⅱ期14 例，Ⅲ+Ⅳ期46 例。 均簽署知情同意書。 另選擇同期門診體檢的健康人62例（對照組），男45 例，女17 例，年齡35～70 歲，平均47 歲。2組性別、年齡比較差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 主要試劑

基因組DNA 提取試劑盒（北京天為時代公司）、2×Taq PCR MasterMix（北京天為時代公司）、DNA marker（Takara,Japan）、人TNF-α 引物（上海生工公司）、NcoⅠ（Fermentas）、MspⅠ（Fermentas）等。

1.3 方法

1.3.1 標本采集

采集肺癌組患者及對照組體檢健康者空腹、外周靜脈血2 mL。

1.3.2 基因多態性分析

采用PCR-RFLP 分析基因型，按照試劑盒操作方法提取全基因組DNA。 PCR 反應體系總體積為50 μL，內含模板DNA 2 μL ,引物各1 μL，4×dNTP 4 μL，10×butter (不含Mgcl2)5 μL，Mgcl23 μL， Taq酶(3 U·μL-1) 1 μL, 雙蒸水25 μL。 將反應液置于PCR 擴增儀中，反應條件： 預變性95 ℃5 min，變性95 ℃45 s，退火59 ℃45 s，延伸72 ℃45 s 共40個循環，最后在72 ℃下延伸10 min。 擴增完畢后，取10 mL PCR 反應產物用10 U 限制性內切酶StyI消化，反應體系為總體積20 μL，擴增后DNA 10 μL，10×buffer 2.5 μL，BSA 0.3 μL，StyI 酶0.5 μL，雙蒸水6 μL，并在37 ℃水浴中4 h 以上。 用12%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離反應產物，電泳分離完畢，置于300 nm 紫外燈下檢測，觀察電泳條帶，以特定的DNA marker 為參照，確定基因型（封四圖1-2）。TNF-α-308 G/G：-87 bp 條帶；TNF-α-308 A/A：-107 bp 條帶；TNF-α-308 G/A：87 bp、107 bp 2條帶；TNF-α-238 G/G：-152 bp 條帶；TNF-α-238 A/A：-132 bp 條帶；TNF-α-238 G/A：-152 bp、-132 bp 2 條帶。

1.4 統計學方法

基因型和等位基因頻率采用直接計數法，各組基因型和等位基因頻率差異比較采用χ2檢驗或確切概率法檢驗來判斷TNF-α 基因-308 G＞/A、-238 G＞/A 多態現象與非小細胞肺癌的相關性。

2 結果

2.1 TNF-α 基因啟動子-308 位點多態性現象與非小細胞肺癌的關系

肺癌組與對照組均未檢測出TNF-α-308 A/A純合子基因型，G/G 基因型頻率在2組的分布中差異有統計學意義（P＜0.01）。 鱗癌組與腺癌組、Ⅰ+Ⅱ期組與對照組的G/G 基因型與G/A 基因型在分布頻率上比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）。 Ⅲ+Ⅳ期組與對照組的基因型分布頻率上比較差異有統計學意義（P＜0.05）。 但G/G 基因型與G/A 基因型在不同分期肺癌組中的分布的比較差異無統計學意義（P＞0.05）。 見表1。

表1 TNF-α-308 位點多態性與非小細胞肺癌及病理類型、臨床分期的關系

2.2 TNF-α 基因啟動子-238 位點多態性現象與非小細胞肺癌的關系

肺癌組與對照組均未檢測出TNF-α-238 A/A純合子基因型，G/G 基因型頻率在2組的分布上差異有統計學差異（P＜0.05）。鱗癌組、腺癌組與對照組相比，G/G 基因型與G/A 基因型頻率分布的比較差異均有統計學意義（P＜0.05），但G/G 基因型與G/A基因型在鱗癌組與腺癌組的分布頻率、腺癌組與對照組中的分布頻率差異無統計學意義（均P＞0.05）。Ⅰ+Ⅱ期組與對照組的基因型分布頻率比較差異無統計學意義（P＞0.05）。Ⅲ+Ⅳ期組與對照組的基因型分布頻率上比較差異有統計學意義（P＜0.05），但G/G 基因型與G/A 基因型在不同分期肺癌組中的分布差異無統計學意義（P＞0.05）。 見表2。

表2 TNF-α-238 位點多態性與非小細胞肺癌及其病理類型、臨床分期的關系

3 討論

TNF-α 在惡性腫瘤的發生發展過程中起重要作用，TNF-α 的表達主要受轉錄水平的調節，TNF-α基因啟動子的多態現象和TNF-α 的產物水平相關［5］。 TNF-α 基因在啟動區域內-308 位點存在著2個基因多態：TNF-α1 基因型和TNF-α2 基因型。 分析-308 位點多態性對基因轉錄的影響，發現TNF-α2基因型的患者體內TNF-α 水平明顯高于TNF-α1基因型［6-7］。 同樣，TNF-α 基因在啟動區域內-238A位點也存在著基因多態現象，存在G→A 變化。有研究認為，銀屑病患者中-238 A 與TNF-α 的低表達密切相關；TNF-α 啟動區域內-308、-238 位點的多態現象與肝癌、前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌等惡性腫瘤的易感性有關［8-10］。

本實驗研究結果顯示：肺癌組及對照組均未檢測出TNF-α-308 A/A、TNF-α-238 A/A 純合子，可能與其基因型在人群中分布頻率低及樣本量較小有關。 肺癌組基因型分布頻率高于對照組，因此推測TNF-α-308 位點的基因多態現象與非小細胞肺癌存在一定的關聯。 在Ⅰ＋Ⅱ期組與對照組的比較中，TNF-α-308 G/A 基因型分布頻率無明顯差異，而Ⅲ＋Ⅳ期組其分布頻率明顯高于對照組，提示TNF-α-308 A 等位基因對肺癌的發生發展可能有促進作用。肺癌組TNF-α-238 G/A 基因型低于對照組，說明其等位基因多態現象與非小細胞肺癌的發生也存在關聯。 Ⅰ＋Ⅱ期組與對照組比較，基因型頻率分布無明顯差異，Ⅲ＋Ⅳ期組與對照組比較，基因型頻率分布差異有統計學意義，提示TNF-α-238 等位基因可能與疾病進展有關，但也可能與樣本含量較小不能進行多元回歸分析或基因分布頻率低有關。 且所研究的對象均為江西人，因此不能排除人種區別。 本研究沒有分析基因多態性對各種治療的影響，有待于今后密切隨訪患者，擴大樣本含量進行研究。

［1］胡成平.肺癌流行病學與煙草控制的研究進展［J］.中國肺癌雜志,2008,11（1）：25-28.

［2］朱佳杰.肺癌發生相關基因的研究進展［J］.醫藥論壇雜志,2011,26（7）：203-206.

［3］Deshpande A,Nolan J P,White P S,et al.TNF-alpha promoter polymorphisms and susceptibility to human papillomavirus 16-associated cervical cancer ［J］.J Infect Dis，2005,191（6）：969-976.

［4］Shih C M,lee Y L,Chiou H L,et al.Association of TNFalpha polymorphism with susceptibility to and severity of non-small cell lung cancer［J］.Lung Cancer,2006,52（1）：15-20.

［5］Basturk B,Yavascaoglu I,Vuruskan H,et al.Cytokine gene polymorphisms as potential risk and protective factors in renal cell carcinoma［J］.Cytokine,2005,30（1）：41-45.

［6］向春艷，何小燕，李逐波，等.TNF-α 在癌癥中的作用研究進展［J］.生命科學，2012,24（3）：250-252.

［7］Ito H,Koide N,Hassan F,et al.Lethal endotoxic shock using alpha -galactosylceramide sensitization as a new experimental model of septic shock［J］.Lab Invest,2006,86（3）：254-261.

［8］Kamali Sarvestani E,Merat A,Talei A R.Polymorphism in the genes of alpha and beta tumor necrosis factors（TNFalpha and TNF-beta）and gamma interferon（IFN-gamma）among lranian women with breast cancer［J］.Cancer Lett,2005,223（1）：113－119.

［9］Duarte I,Santos A,Sousa H,et al.G-308A TNF-alpha polymorphism is associated with an increased risk of invasive cervical cancer［J］.Biochem Biophys Res Commun,2005,334（2）：588-592.

［10］魏廣金,李啟忠,宋娟,等.腫瘤壞死因子β 基因多態性與膀胱移行細胞癌的相關性研究［J］.河南醫學研究,2008,17（1）：26-28.