針刺督脈經穴對局灶性腦缺血再灌注大鼠缺血半暗帶MAP-2、NF-L的mRNA表達的影響

王淑蘭,倪光夏,2

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針刺督脈經穴對局灶性腦缺血再灌注大鼠缺血半暗帶MAP-2、NF-L的mRNA表達的影響

王淑蘭1,倪光夏1,2

(1.南京中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院,南京 210029;2.江蘇省第二中醫(yī)院,南京 210017)

觀察針刺督脈經穴對腦缺血再灌注大鼠缺血半暗帶神經細胞骨架結構微管相關蛋白MAP-2和神經微絲蛋白NF-L的mRNA表達的影響,并探討其可能的作用機制。以針刺督脈經穴為干預手段,以大鼠急性局灶性腦缺血再灌注模型作為研究對象,運用SYBR Green實時定量PCR觀測腦缺血再灌注后缺血半暗帶MAP-2和NF-L的mRNA表達變化,并觀察針刺對上述指標的調節(jié)作用規(guī)律。針刺組和對照組MAP-2和NF-L的mRNA表達較模型組均顯著升高(＜0.01),且針刺組升高更顯著(＜0.05)。針刺督脈經穴能上調MAP-2和NF-L的mRNA表達,促進神經元樹突和軸突的出芽和再生,提高神經元的可塑性,可能是針刺督脈經穴發(fā)揮神經保護作用的機制之一。

針刺;電針;腦缺血再灌注;大鼠;PCR

腦梗死(Cerebral Infarction)是由于腦部血流供應障礙,缺血、缺氧引起的局灶性腦組織的缺血性壞死或軟化。其發(fā)病率、病死率、致殘率和復發(fā)率均較高,不僅嚴重影響患者的生活質量,而且為社會和家庭帶來沉重的經濟和心理負擔,探尋有效的治療方法一直是醫(yī)學領域的研究方向。本實驗應用線栓法制備大鼠局灶性腦缺血與再灌注模型,通過針刺督脈經穴,觀察神經細胞微管相關蛋白MAP-2和神經微絲蛋白NF-L 的mRNA表達變化,進一步探討針刺保護腦缺血后神經細胞損傷的作用機制。

1 材料和方法

1.1 動物與分組

清潔級雄性SD大鼠40只,體重(150±10)g,購自上海西普爾-必凱實驗動物有限責任公司[動物許可證號:SCXK(滬)2008-0016],飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學實驗動物中心。按隨機數字表法分為正常組、假手術組、缺血再灌注模型組(模型組)、針刺督脈經穴組(針刺組)、針刺陽明經穴組(對照組),共5組,每組8只。

1.2 主要儀器及試劑

韓氏LH402A穴位神經電刺激儀,核酸蛋白測定儀(Eppendorf公司),基因擴增儀MJ-mini(BIO-RAD公司),實時定量PCR儀Mx3000P(Stratagene公司),總RNA提取試劑RNAiso Plus(Takara公司),反轉錄試劑盒PrimeScript RT Master Mix(Takara公司),SYBR Premix Ex Taq(Takara公司)。

1.3 模型制備

參照Longa[1]線栓法并加以改進。SD大鼠用10%水合氯醛(0.3 mL/100 g體重i.p)麻醉,仰臥固定。常規(guī)消毒后,于頸部正中切開,鈍性分離右側頸總動脈(common carotid artery,CCA)、頸外動脈(external carotid artery,ECA)、頸內動脈(internal carotid artery,ICA)。結扎ECA遠心端,用微型動脈夾夾住CCA近心端及ICA,在靠近CCA分叉處用眼科剪在ECA上剪一小口,將直徑0.235 mm的尼龍釣絲用火烤成小球的一端沿小切口插入ECA,剪斷ECA遠心端,將ECA反向拉直,使其與ICA處于同一直線上,移去ICA的動脈夾,經CCA分叉處將釣絲緩慢向ICA入顱腦內的方向推進約17～18 mm,微遇阻力時停止,使釣絲頭端到達較細的大腦中動脈起始處?？`緊預先放置于穿刺小切口處的絲線,縫合,消毒,于缺血2 h后拔出栓線,建立缺血再灌注模型。假手術組大鼠只分離暴露CCA、ECA、ICA,結扎ECA。正常組不進行手術處理。

參考Bederson6級5分法。正常為5級(0分);對側上肢不能完全伸展為4級(1分);向對側推時抵抗力下降為3級(2分);提尾時向對側轉圈為2級(3分);自動轉圈為1級(4分);無自發(fā)性活動、意識障礙為0級(5分)。對再灌注后大鼠即刻進行神經行為學評分,達到1～4分視為造模成功。之后觀測缺血再灌注24 h后各組大鼠神經行為學評分以明確其變化。

1.4 治療方法

取穴根據中國針灸學會實驗針灸研究會制定的“動物針灸穴位圖譜”選取相應穴位。針刺組取穴以督脈經穴為主,取水溝、百會、風府、大椎。在動物模型制備成功1 h時進行1次針刺。選用蘇州醫(yī)療用品廠有限公司出品的0.30 mm×13 mm針灸針進行治療。水溝直刺深度為0.2寸;百會向后呈15°平刺,采用快速捻轉的手法2 min;風府、大椎穴直刺0.2～0.3寸,1 min/穴/次,行平補平瀉。此外,分別對水溝、百會,風府、大椎通韓氏LH402A穴位神經電刺激儀,頻率為2 Hz,強度為2 mA。

1.5 標本處理

確認各組模型已建立。于造模后24 h斷頭處死動物,快速取腦,取病變側,將缺血中心壞死區(qū)、嗅球及小腦去掉,取缺血壞死區(qū)周圍的缺血半暗帶,迅速放入液氮中冷凍,稍后置于﹣80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 腦組織MAP-2、NF-L的mRNA表達檢測

運用SYBR Green實時定量PCR檢測方法檢測腦組織中MAP-2、NF-L的mRNA表達。

1.6.1 總RNA制備

腦組織100～200 mg,分別加入1 mL RNAiso Plus,按試劑說明書中操作步驟進行RNA提取。使用Eppendorf公司的核酸蛋白測定儀檢測抽提總RNA的質量和濃度。要求A260/A280比值約2.0,并計算RNA含量。

1.6.2 cDNA合成

反應體系30mL。取5×PrimeScript Buffer(含有PrimeScript RTase、RNase Inhibitor、Random 6 mers、Oligo dT Primer、反應Buffer)6mL,每一標本取總RNA 1.5mg,加RNase Free dH2O至30mL。37℃ 15 min,85℃ 5 s進行逆轉錄。

1.6.3 引物

MAP-2和NF-L基因使用引物設計軟件primer5.0,分別參照GeneBank序列號NM_013066.1和NM_031783.1跨內含子設計,大連Takara合成。MAP-2上游引物為CAGAACAAACAGCTGCACTGGA(方向為5’to 3’);下游引物為TCTAAAGGCTCAGCGAATGAGGA(5’to 3’)。NF-L上游引物為CCATCAGCAACGACCTCAAGTCTA (5’to 3’);下游引物為CGGCTTCCAGGACCTTGTTC(5’to 3’)。b-actin作為內參。

1.6.4 SYBR Green實時定量PCR

25mL的反應體系中包括:SYBR Premix Ex Taq(內含Takara Ex Taq HS, dNTP Mixture,Mg2﹢,Tli RNaseH,SYBR GreenⅠ等) 12.5mL;上下游引物各5mL(1mmol);ROX Reference DyeⅡ(用于校正孔與孔之間的熒光信號誤差)0.5mL; cDNA標本2mL。反應體系加入實時定量PCR儀Mx3000P (Stratagene公司)進行PCR擴增。兩步法PCR擴增,預變性反應條件為95℃ 30 s,1Cycle;PCR反應為95℃ 5 s,60℃ 20 s,40 Cycle。將檢測的臨界點設定在PCR擴增過程中,熒光信號由本底進入指數增長階段的拐點所對應的循環(huán)數(threshold cycle,Ct)值處。

1.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS17.0對數據資料進行統(tǒng)計分析。計量數據用均數±標準差表示,多組間比較采用完全隨機設計的單因素方差分析,組間比較方差齊時選擇LSD法。同組間治療前后比較采用配對檢驗,差值d不服從正態(tài)分布時選擇非參數檢驗。以＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠行為學評分比較

由表1可見,模型組、針刺組、對照組大鼠神經功能評分與正常組和假手術組比較,差異均具有統(tǒng)計學意義(＜0.05)。針刺組、對照組治療前大鼠神經功能評分與模型組比較,差異均無統(tǒng)計學意義(＞0.05)。針刺組、對照組治療后大鼠神經功能評分與模型組比較,差異均具有統(tǒng)計學意義(＜0.01)。針刺組、對照組治療后大鼠神經功能評分與同組治療前比較,差異均具有統(tǒng)計學意義(＜0.05)。針刺組治療后大鼠神經功能評分與對照組比較,差異具有統(tǒng)計學意義(＜0.05)。

表1 各組大鼠神經功能評分比較 (±s,分)

注:與正常組、假手術組比較1)＜0.05;與模型組比較2)＜0.01;與對照組比較3)＜0.05;同組內治療前比較4)＜0.05

2.2 各組MAP-2、NF-L的mRNA水平比較

采用b-actin作為內參,利用樣本MAP-2、NF-L與b-actin的mRNA含量的比值,作為評價MAP-2和NF-L的mRNA相對表達水平的指標。以2﹣△△Ct法表示相對定量結果。根據公式△Ct=[Ct(MAP-2或NF-L)]－[Ct(b-actin)]、△△Ct=[△Ct(實驗組))－[△Ct(正常組)],2﹣△△Ct表示實驗組MAP-2或NF-L相對于正常組原始拷貝數的倍數差異,即表示MAP-2或NF-L在兩組表達的相對變化。

表2 各組MAP-2、NF-L的mRNA水平比較 (±s)

注:與正常組比較1)＜0.01;與模型組比較2)＜0.01;與對照組比較3)＜0.05

由表2可見,正常組大鼠腦組織中有少量MAP-2和NF-L的mRNA表達。假手術組MAP-2和NF-L的mRNA表達與正常組比較,差異均無統(tǒng)計學意義(＞0.05)。模型組MAP-2和NF-L的mRNA表達較正常組明顯下降(＜0.01)。與模型組比較,針刺組和對照組MAP-2和NF-L的mRNA表達均上調(＜0.01),且與對照組比較,針刺組上調更為顯著(＜0.05)。

3 討論

神經元對缺血敏感,腦梗死發(fā)生后,梗死區(qū)的神經元即發(fā)生不可逆性損傷,而缺血半暗帶區(qū)的神經元則處于可逆狀態(tài)。挽救這些殘存腦組織,恢復神經運動功能是當務之急。而神經系統(tǒng)突觸的結構和功能的可塑性是恢復神經運動功能的基礎。神經元樹突及軸突的出芽和再生是神經元在損傷及缺血時發(fā)生可塑性變化的重要標志[2]。

MAP-2和NF均為神經細胞骨架的成分,分別存在于神經細胞的樹突和軸突以及胞體中,兩者對于神經元的發(fā)育、分化、重塑、細胞結構的維持、神經元突起的生長等具有重要意義[3]。NF分別由低相對分子質量(NF-L)、中等相對分子質量(NF-M)和高相對分子質量(NF-H)3種亞單位組成,我們選取NF-L為觀測指標。本研究結果表明,針刺督脈經穴能使局灶性腦缺血再灌注大鼠缺血半暗帶區(qū)MAP-2和NF-L的mRNA表達上調,由此證實針刺督脈經穴能促進神經元樹突和軸突的出芽和再生,提高神經元的可塑性,從而改善神經功能缺損狀態(tài),發(fā)揮神經保護作用。

[1] Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S,. Reversible middlecerebral artery occusion without craniectomy in rats[J]. Stroke, 1989,20(1): 84-91.

[2] Glauser T, Ben-Menachem E, Bourgeois B,. ILAE treatment guidelines: evidence-based analysis of antiepileptic drug efficacy and effectiveness as initial monotherapy for epileptic seizures and syndromes[J]. Epilepsia, 2006,47(7):1094-1120.

[3] LoPachin RM, He D, Reid ML. 2, 5-Hexanedione-induced changes in the neurofilament subunit pools of rat peripheral nerve[J]. Neuroto- xicology, 2005,26(2):229-240.

Effect of Acupuncture at Du Meridian Points on the Expressions of MAP-2 and NF-L mRNAs in the Ischemic Penumbra in Rats with Focal Cerebral Ischemia and Reperfusion

-1,-1,2.

1.,210029,; 2.,210027,

To investigate the effect of acupuncture at Du meridian points on the expressions of neuronal microtubule- associated protein 2 (MAP-2) mRNA and neurofilament protein L (NF-L) mRNA in the ischemic penumbra in rats with cerebral ischemia and reperfusion and explore the possible mechanism of its action.Acupuncture at Du meridian points was used as an Interventional measure. A rat model of focal cerebral ischemia and reperfusion was used as a subject. The expressions of MAP-2 and NF-L mRNAs in the ischemic penumbra were examined using SYBR Green real-time and quantitative PCR after cerebral ischemia and reperfusion. Regularities in the adjusting effect of acupuncture on the above indices were observed.The expressions of MAP-2 and NF-L mRNAs increased significantly in the acupuncture and control groups compared with the model group (＞0.01) and increased more in the acupuncture and control group (＜0.05).Acupuncture at Du meridian points can upregulate the expressions of MAP-2 and NF-L mRNAs, promote the germination and regeneration of neuronal dendrites and axons and improve neuronal plasticity. That may be one of the mechanisms by which acupuncture at Du meridian points produces a protective effect on the nerve.

Acupuncture; Electroacupuncture; Cerebral ischemia and reperfusion; Rats; PCR

1005-0957(2013)03-0221-03

R2-03

A

10.3969/j.issn.1005-0957.2013.03.221

2012-10-13

王淑蘭(1986 - ),女,住院醫(yī)師

倪光夏(1964 - ),男,主任醫(yī)師,博士生導師,E-mail:gn66@ 163.com