不同劑量活性維生素D對大鼠細胞自噬的影響

冷 婧 邱 齡*

（山西醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院心內(nèi)科，太原 030001）

不同劑量活性維生素D對大鼠細胞自噬的影響

冷 婧 邱 齡*

（山西醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院心內(nèi)科，太原 030001）

目的 探討在生理狀況下不同劑量活性維生素D3（VD3）干預(yù)下老年大鼠是否發(fā)生細胞自噬，以及發(fā)生自噬的情況。方法 18月齡SD大鼠32只按體質(zhì)量隨機分為4組：A組：對照組；B組：低劑量活性VD3組[（0.01μg/kg）/d]；C組：中劑量活性VD3組[（0.1μg/kg）/d]；D組：高劑量活性VD3組[（0.4μg/kg）/d]。經(jīng)過5個月灌胃不同劑量活性VD3干預(yù)后處死，取1mm3肝臟組織4℃保存，取其余肝組織，生理鹽水沖洗，錫紙包裹-80℃保存。透射電鏡觀察大鼠肝臟細胞自噬情況。通過western-blot的方法測定自噬小體標志物LC3對細胞的自噬活性進行半定量分析。結(jié)果 在生理狀況下不同劑量活性維生素D的干預(yù)導(dǎo)致大鼠細胞自噬泡與胞漿的比值：A、B、C、D四組大鼠自噬泡與胞漿比值之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。兩兩比較結(jié)果，A組與B、C、D組差異都有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），B組和C組之間差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），B組和C組都與D組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。LC3II/LC3I結(jié)果與大鼠細胞自噬泡與胞漿的比值相同。結(jié)論 在生理狀況下長期大劑量給予不同劑量活性維生素D可對老年大鼠細胞自噬產(chǎn)生不同影響。

細胞自噬；活性維生素D；LC3

自噬是一種在進化上高度保守的溶酶體自我消化的過程，對細胞內(nèi)動態(tài)平衡，分化和存活有著至關(guān)重要的意義。作為一種適應(yīng)性反應(yīng)，研究人員發(fā)現(xiàn)，適度的激活細胞自體吞噬能夠凈化自身衰老或者受損的蛋白質(zhì)和細胞器從而達到延緩衰老的功效，還能夠控制和治療與衰老有關(guān)的慢性疾病如心腦血管疾病、糖尿病和癌癥等[3]，如何通過激活細胞自噬而達到抗衰老，預(yù)防疾病，延長壽命的目的已經(jīng)成為了國內(nèi)外研究者的熱門課題。

維生素D是一種脂溶性、活性、激素樣維生素，1，25（OH）2VD3是它的活性形式。在最近的二十年來隨著分子生物學(xué)，細胞生物學(xué)的不斷進步，研究人員發(fā)現(xiàn)維生素D在人體的不同細胞調(diào)控著不同基因的表達控制他們的增殖、分化和存活[4-8]。近幾年來，VD3由于其在抵抗衰老和影響基因表達方面的作用而被人們從新認知。他們認為細胞自噬在維生素D的影響下對健康發(fā)揮著更加重要的作用[3]。在關(guān)于癌癥和結(jié)核分離桿菌感染的治療的研究中表明大劑量的活性維生素D可以引起細胞內(nèi)自噬溶酶體發(fā)生作用，從而引起細胞自噬[10-11]。但在生理情況下，大劑量活性維生素D是否引起細胞自噬并不確定。

本研究擬通過添加不同劑量活性VD3擬誘導(dǎo)構(gòu)建活性VD3誘導(dǎo)老齡大鼠細胞自噬模型。以透射電子顯微鏡觀察細胞自噬現(xiàn)象，用western-blot方法檢測實驗大鼠肝臟組織LC3表達，通過比較不同組別間實驗大鼠C3II/LC3I的比值，明確不同組別大鼠發(fā)生細胞自噬的程度和差異，以期明確在生理狀況下活性VD3對于細胞自噬的作用。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

透射式電鏡（日本日立H I-TACH I公司H-600）；超薄切片機（瑞典LKB公司LKB-V）；超聲波粉碎儀（美國sonics公司CPX130）；脫色搖床（中國其林貝爾公司9550）；酶標儀（美國MD公司spectra Maxplus384）；紫外凝膠成像系統(tǒng)（美國protein simple公司Alpha Fluor chemHD2）；恒溫水浴鍋（中國HHS-11-4）；高速冷凍離心機（美國索福ST16R）；電泳儀（美國伯樂041BR）；蛋白電泳半干轉(zhuǎn)儀（美國伯樂221BR）；精密電子天平（瑞士梅特勒公司PL402-L）漩渦混勻器VEKTEX-5：（其林貝爾儀器制造有限公司）。

活性VD購自sigma公司純度為99%，LC3抗體購自sigma公司，14月齡SD雄性大鼠，體質(zhì)量320～470g以及飼料（山西醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠分組及取材

大鼠32只自由飲食洗脫2周，飼料為全價顆粒料（主要營養(yǎng)成分：粗蛋白19.31%、粗脂肪2.9%、粗纖維3.1%、水分8.7%、鈣0.5%、磷0.5%），2周飲食洗脫后后按體質(zhì)量隨機分為：A組：不添加維生素D組；B組：低劑量活性維生素D組[（0.01μg/kg）/d]；C組：中劑量活性維生素D組[（0.1μg/kg）/d]；D組：高劑量活性維生素D組[（0.4μg/kg）/d]。普通環(huán)境飼養(yǎng)，灌胃所用活性維生素D溫度20～24℃，濕度55%～80%，自然光照，飲用自來水，每周換墊料2次。大鼠以及飼料均由山西醫(yī)科大學(xué)動物中心提供。觀察并記錄各組大鼠的一般情況（進食、飲水、活動等）及，每周檢測體質(zhì)量并記錄，以便評估其健康狀態(tài)及營養(yǎng)狀況。

飼養(yǎng)5個月后，A、B、C、D四組大鼠均應(yīng)禁食24h后次日清晨開始采集標本。用3%的戊巴比妥鈉麻醉大鼠后切開皮膚及皮下組織暴露肝臟，快速剪下一小塊肝臟組織在預(yù)冷的固定液30s內(nèi)切成1mm3大小的組織塊，置于2%的戊二醛固定液2h后緩沖液沖洗后浸泡，4℃保存?zhèn)溆谩Ｇ腥〈笫笫Ｓ嗖糠指闻K，用預(yù)冷生理鹽水沖洗后，切成均勻的小塊包入錫紙中，放入-80℃冰箱備用。

1.2.2 透射電鏡觀察肝細胞自噬泡

經(jīng)過常規(guī)取材、雙重固定、脫水、浸透、包埋、切片（厚度為50nm）、醋酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛雙重染色后，透射電鏡觀察、拍照、記錄。

1.2.3 用western-blot的方法半定量檢測自噬小體標志物LC3

1.2.3.1 western-blot系統(tǒng)儲備液體的配置

丙烯酰胺儲備液：1g的甲叉丙烯酰胺，29g的丙烯酰胺溶于60mL三蒸水中加熱溶解定溶到100mL后過濾，放4℃保存。5×電泳緩沖液：15.1gtris堿、94g甘氨酸、50mL10%的SDS加三蒸水后用HCl調(diào)節(jié)pH至8.3，定溶于1000mL放4℃保存。凝膠緩沖液：tris-HCL8.8，1.5M tris-base溶于三蒸水中，HCL調(diào)pH至8.8定溶于1000mL放4℃保存。tris-HCL6.8，1M tris-base溶于三蒸水中，HCL調(diào)pH至6.8定溶于1000mL放4℃保存。10gSDS定溶于100mL水中配置成10%的SDS溶液室溫保存。0.1gAPS溶于1mL三蒸水中避光4℃保存，一周內(nèi)使用。轉(zhuǎn)膜緩沖液：200mL甲醇、14.4g甘氨酸、3gtris-base溶于三蒸水后調(diào)pH至8.3定容于1L水中4℃保存。

1.2.3.2 蛋白樣品的提取

將標本解凍后取50mg組織塊用預(yù)冷干凈的刀片盡量切碎，按說明加入500uL的RIPA裂解并加入PMSF液置于超聲細胞破碎儀中超聲低溫勻漿，直至組織碎塊完全勻漿，放入4℃冰箱充分裂解1～3h后低溫離心收集取上清。整個過程，于冰上操作。用BCA蛋白測定分析盒測定各組蛋白濃度，并用裂解液調(diào)節(jié)各組總蛋白濃度相等，并計算蛋白上樣量。

1.2.3.3 SDS-PAGE電泳、半干轉(zhuǎn)膜、免疫印跡等實驗步驟詳細參考分子克隆實驗指南以及本校中心實驗室的操作，并根據(jù)實驗結(jié)果優(yōu)化選擇。制備好干凈的玻璃板，灌入預(yù)先配置好的15%的分離膠5mL，加正丁醇壓平，凝固后加入5%濃縮膠并迅速插入梳子。將樣本1∶1混合2×的上樣緩沖液，煮沸5min后迅速放入冰中，使其快速冷卻。等濃縮膠凝固后，把梳子拔出，在第一個齒孔位置加入預(yù)染marker然后依次進行上樣。上樣之后進行電泳，在濃縮膠上加電壓為80v，至分離膠后，轉(zhuǎn)換電壓為120v，直至溴酚藍跑到底部。將跑好的膠切分后，把有條帶的部分進行半干轉(zhuǎn)。半干轉(zhuǎn)后洗膜3次，每次5min，之后用用TBST配置成的5%富含V成分的牛血清白蛋白封閉液在室溫下?lián)u床封閉2h，再洗3次膜，每次5min。根據(jù)預(yù)染maker的位置大概判斷?-actin和目的條帶的位置將膜剪切后加入分別加入?-actin抗體和LC3抗體過夜。隔日洗膜三次每次5min，加入分別加入?-actin和LC3抗體的二抗，室溫搖床孵育2h，之后洗膜3次，每次5min，進行曝光。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié)果采用SPSS16. 0軟件包建立數(shù)據(jù)庫，并進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)資料以表示。各組細胞自噬小體與胞漿的比值因方差不齊所以用秩和檢驗（Kruskal-Wallis H test），兩組之間的進一步比較采用LSD-t多重比較，檢驗水準α=0.05。各組細胞自噬小體LC3II/LC3I的結(jié)果比較用單因素方差分析，檢驗水準α=0.05，兩組之間的進一步比較采用擴展的t檢驗法，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 透射電鏡觀察肝細胞自噬泡?

A組：不添加活性維生素D組肝臟，細胞核內(nèi)染色質(zhì)分布均勻，核仁明顯；脂滴較多，線粒體嵴結(jié)構(gòu)清晰，核糖體較多，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分布在細胞質(zhì)，自噬溶酶體少見。B組和C組：肝臟細胞核內(nèi)染色體輕度凝集、邊聚，核仁可見，細胞質(zhì)內(nèi)線粒體豐富，腫脹明顯，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴張，自噬溶酶體數(shù)量較多。D組：肝臟細胞核圓形，核內(nèi)染色質(zhì)輕度邊聚，線粒體豐富，線粒體輕度腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴張，自噬溶酶體較多。自噬泡為單層或雙層膜包裹著的處于不同降解階段的胞質(zhì)成分或廢棄的細胞器經(jīng)消化降解后形成的板層樣結(jié)構(gòu)。見圖1和表1。

圖1 所示：A組為不添加VD組，B組為低劑量VD組，C組為中劑量，D組高劑量VD組

表1 自噬泡與胞漿面積的比值

因為四組自噬泡與胞漿的比值因方差不齊，所以采用了秩和檢驗（Kruskal-Wallis H test）。χ2=12.793，P＜0.05，P=0.005。總的來講四組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。各組細胞自噬泡與胞漿比值在兩組之間的進一步比較采用擴展的t檢驗法，兩兩比較結(jié)果，A組與BCD組差異都有統(tǒng)計學(xué)意義，B組和C組差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義，二者都與D組差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2 用western-blot檢測自噬小體標志物LC3II/LC3I的比值

見表2。

表2 細胞自噬小體LC3II/LC3I的比值

多組之間的比較用單因素方差分析，F(xiàn)=8.711，P＜0.0001。總的來講四組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。進一步采用LSD-t進行多組之間的兩兩比較。結(jié)果：不添加VD3組與每個組差異都有統(tǒng)計學(xué)意義，低劑量VD3組和中劑量VD3組差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義，二者都與高劑量VD3差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見圖2。

圖2

不同組別LC3II/LC3I比值，見圖3。

圖3

3 討 論

細胞自噬是一種在進化上高度保守的降解過程，是通過降解受損蛋白、細胞器以及有潛在危險病原體的細胞來保護機體的一種機制[2,12]。細胞自噬貫穿于正常細胞生長發(fā)育和生理病理過程中，能清除細胞內(nèi)過量的或受損的細胞器和蛋白質(zhì)，對維持蛋白質(zhì)代謝平衡和細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定起重要作用，它對防止老化、延長壽命有積極作用[13]。研究表明細胞自噬與衰老及抗衰老密切相關(guān)，隨著年齡的增加自噬功能下降，長期抑制細胞自噬加速了衰老，有研究證明在大鼠長期刺激自噬可延緩衰老的過程[9]。

隨著分子生物學(xué)，細胞生物學(xué)的不斷進步，VD3由于其在抵抗衰老和影響基因表達方面的作用而被人們從新認知。研究人員發(fā)現(xiàn)VD3在人體的不同細胞調(diào)控著不同基因的表達，通過大量的研究確定VD3直接影響著人類229個基因的活性[14]，增強和減弱大約900多種不同基因的表達[15]。它對除了已經(jīng)成為老生常談的抗佝僂病作用之外還與大部分老年慢性疾病，如心臟病、糖尿病、高血壓、癌癥等發(fā)生發(fā)展都有著密切的關(guān)聯(lián)[16]，更有研究發(fā)現(xiàn)VD3可以部分逆轉(zhuǎn)老年大鼠眼底的黃斑變性[17]。第一次關(guān)于維生素D化合物激活自噬的研究來自由維生素D衍生物1，25（OH）2VD3和EB1089對癌癥細胞引起的特殊的細胞毒作用[18]。用1，25（OH）2VD3和EB1089治療乳腺癌引起的是一種非典型的細胞死亡獨立于凋亡蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶引起的凋亡[19]即細胞自噬。在近幾年的研究中發(fā)現(xiàn)，在對一些癌癥和感染的病理治療中發(fā)現(xiàn)，大劑量活性維生素D3可以誘發(fā)細胞自噬。他可能的機制是通過增加胞漿內(nèi)游離鈣濃度，激活CAMKK-?，再激活A(yù)MPK[20-21]，磷酸化TSC1/TSC2，阻止了PHEB的表達，減少了對mTOR的正反饋，導(dǎo)致ATG蛋白合成，細胞自噬發(fā)生。在單核細胞中VD引起的細胞自噬可能通過的旁路途徑：通過維生素D3受體上調(diào)蛋白hCAP-18衍生出來的LL-37縮氨肽，不僅可以參與構(gòu)建自噬泡結(jié)構(gòu)，而且通過上調(diào)Atg-5，Atg-6，Beclin-1促進自噬泡和溶酶體融合[21]。以上研究是在癌癥和感染時大劑量活性VD3衍生物在動物體內(nèi)發(fā)生的促進細胞自噬的作用，但是在生理狀況下使用大劑量維生素D3誘發(fā)細胞自噬的研究還沒有。

在以往對于誘導(dǎo)細胞自噬的研究中發(fā)現(xiàn)，有很多能誘導(dǎo)細胞自噬的有多種形式，比如饑餓、缺氧、感染以及使用一些用于治療癌癥的藥物等[8]本實驗通過在生理狀況下使用不同劑量活性維生素D3干預(yù)不同組別大鼠，經(jīng)過一段時間干預(yù)后，取大鼠肝臟組織，檢測通過透射電鏡觀察各組大鼠肝臟細胞自噬的情況，經(jīng)過計算顯示：三個不同劑量維生素D3干預(yù)組自噬泡占胞質(zhì)總面積的比值明顯大于對照組自噬泡占胞質(zhì)總面積的比值，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。低劑量和中劑量活性VD3干預(yù)組大鼠細胞自噬泡占胞質(zhì)總面積的比值，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義。高劑量活性VD3組與低劑量和中劑量活性VD3組大鼠細胞自噬泡占胞質(zhì)總面積的比值差異有統(tǒng)計學(xué)意義。使用western-blot的方法檢測自噬小體標志物LC3，通過灰度分析和統(tǒng)計看大鼠細胞自噬程度。對照組大鼠和其余三組維生素D干預(yù)組大鼠LC3II/LC3I差異有統(tǒng)計學(xué)意義，低劑量和中劑量組LC3II/LC3I沒有統(tǒng)計學(xué)意義。兩組都與高劑量組LC3II/LC3I差異有統(tǒng)計學(xué)意義。兩種分析結(jié)果一致。由此可見，在生理狀態(tài)下，大劑量活性VD3可以誘導(dǎo)老年大鼠細胞自噬的發(fā)生，且與劑量有關(guān)。活性VD3是否與維生素D受體結(jié)合并通過基因表達產(chǎn)生抑制mTOR激酶的蛋白表達，激活了mTOR信號途徑進而增強了細胞發(fā)生自體吞噬及其相應(yīng)的細胞機制對細胞自噬的影響等將有待于進一步研究。我們推測將在應(yīng)用臨床藥物控制疾病的同時通過給予合適劑量活性VD3來調(diào)控細胞自噬，對健康產(chǎn)生重要影響，將是細胞自噬在臨床應(yīng)用中的一個方向，對一些老年病，如心腦血管疾病的治療，在藥物控制疾病的基礎(chǔ)上開創(chuàng)新的輔助手段。

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The Effect of Different Dosage of 1-25（OH）2VD3to Rat Autophagy

LENG Jing, QIU Ling
(Department of Cardiology, Second Clinical Medical College, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China)

Objective To explore whether under the physiological condition given different dosage of 1-25（OH）2VD3in aged rats could lead different autophagy. Method Thirty-two male 18-month-old SD rats were randomly divided into 4 groups: A: control group, B: Low dosage of 1-25（OH）2VD3, [0.01 μg/kg×d]; C: middle dosage of 1-25（OH）2VD3[0.1μg/kg × d]; D: high dosage of 1-25（OH）2VD3[0.4, μg/kg × d]. Given the rats with different dosages of 1-25（OH）2VD3. Take the samples after five months. Autophagsomes were observed with Transmission Electron Microscopy, Western-blot detect the expression of LC3 which is the marker proteins for autophagy. And then comparing different of rats LC3 expression occurrence autophagy and degree of difference in different groups. Result Under physiological conditions given different dosage of 1-25（OH）2VD3in four groups lead the proportions of autophagosome to the total area of cytoplasm have significant difference（P＜0.05）.Pairwise comparison results The proportions of autophagosome to the total area of cytoplasm in group A was significantly lower than any other groups（P＜0.05）.There have no statistical different between group B and group C（P＞0.05）.There have significant difference between group B and group D,group C and group D（P＜0.05）.The result of LC3II/LC3I were as same as the result of proportions of autophagosome to the total area. Conclusion To old rats under physiological condition long-term given different large dosage of VD3can lead different autophagy degree in different groups.

Autophagy; 1-25（OH）2VD3; LC3

R54；R329.2+5

B

1671-8194（2013）27-0001-04

山西省自然科學(xué)基金（項目編號：2010011054-2）

*通訊作者