沙利度胺聯合替尼泊苷對人胃腺癌移植瘤生長的影響

高 明趙 丹張自森馬 望張明智*

（1 鄭州大學第一附屬醫院腫瘤科，河南 鄭州 450052；2 鄭州市第三人民醫院腫瘤科，河南 鄭州 450000；3 鄭州大學第五附屬醫院腫瘤內科，河南 鄭州 450000）

沙利度胺聯合替尼泊苷對人胃腺癌移植瘤生長的影響

高 明1趙 丹2張自森3馬 望1張明智1*

（1 鄭州大學第一附屬醫院腫瘤科，河南 鄭州 450052；2 鄭州市第三人民醫院腫瘤科，河南 鄭州 450000；3 鄭州大學第五附屬醫院腫瘤內科，河南 鄭州 450000）

目的 探討沙利度胺聯合替尼泊苷在對胃腺癌BGC-823裸鼠移植瘤生長及腫瘤細胞周期的影響，了解二者聯合對移植瘤的抑制作用。方法 建立人胃腺癌BGC823移植瘤模型，實驗分組，計算抑瘤率，流式細胞儀檢測腫瘤細胞生長周期及凋亡情況。結果 沙利度胺聯合替尼泊苷組腫瘤組織S期細胞比例明顯下降，大量腫瘤細胞阻滯于G2/M期，并可見明顯凋亡峰。結論 替尼泊苷聯合沙利度胺對抑制人胃腺癌BGC823細胞生長具有協同作用，可誘導腫瘤細胞凋亡。

沙利度胺；替尼泊苷；胃腺癌

胃癌發病率在惡性腫瘤中非常高，病死率僅次于肺癌排在第二位[1]。早期診斷比較困難，確診時大多數患者已沒有手術機會，主要治療手段是以化療為主的綜合治療，有效率較低，現沒有標準治療方案[2]。體外研究發現替尼泊苷(VM-26)對人胃腺癌BGC-823細胞具有良好的抑制生長作用[3]。近年來沙利度胺的動物及體外實驗表明其有抑制血管生成等作用，再度受到重視。

1 材料與方法

1.1 材料

①細胞株：人胃腺癌細胞系BGC-823購自中科院上海細胞生物學研究所。②實驗動物：6周齡、BALB/c裸鼠50只，雌雄各半，購自中國藥品生物鑒定所嚙齒類實驗動物種子中心。③藥物：沙利度胺片（50mg/片）由常州制藥饋贈；替尼泊苷注射液由美國百時美施貴寶公司饋贈

1.2 方法

1.2.1 細胞培養方法

人胃腺癌細胞BGC-823在含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養液中生長。

1.2.2 動物實驗

①荷瘤裸鼠模型的建立：取對數生長期細胞消化，加入無血清培養基后離心；應用無血清培養基調整細胞濃度為5×106/mL；每只裸鼠接種1×106（約0.2mL）；②隨機分組：50只裸鼠成瘤率100%，隨機分為5組：空白對照組、沙利度胺組、低劑量VM-26組、高劑量VM-26組及低劑量VM-26聯合沙利度胺組。

1.2.3 實驗分組

成瘤后瘤徑達5mm時開始給藥；VM-26取2.45mg/kg、1.63mg/kg分別作為高劑量及低劑量組實驗用藥劑量；沙利度胺組采用200mg/(kg·d)作為實驗組用藥劑量。①空白對照組：尾靜脈注射0.2mL生理鹽水；②沙利度胺單藥組：經口灌胃沙利度胺200mg/(kg·d)，每日給藥一次；③VM-26高劑量組：尾靜脈注射VM-26注射液2.45mg/kg，每周給藥一次；④VM-26低劑量組：尾靜脈注射替尼泊苷注射液1.63mg/kg，每周給藥一次；⑤沙利度胺聯合VM-26低劑量組：經口灌胃沙利度胺200mg/(kg·d)，每日給藥1次；尾靜脈注射VM-26注射液1.63mg/kg，每周給藥1次；分組后次日開始給藥，連續2周。

1.2.4 計算腫瘤生長抑制率

在用藥前稱裸鼠的體質量，與停藥次日處死動物，剝出瘤塊稱重，計算瘤重抑制率。瘤重抑制率=（對照組瘤重-給藥組瘤重）/對照組瘤重×100%。

表1 各治療組抑制腫瘤作用

表2 各治療組對人胃腺癌細胞生長周期的影響

1.2.5 流式細胞儀檢測細胞周期

剝出瘤塊制成組織標本-80℃冰箱低溫保存，分別制備各組單細胞懸液后，將制備好的膠原蛋白酶溶液2mL加入離心管中；將離心管放入37℃恒溫水浴箱消化30min，后收集細胞懸液過濾、離心再加入PBS 2mL充分混勻，再加入0.5mL PBS重懸細胞；加入預冷的70%冷乙醇，放置4℃固定12h。檢測時加入RNA酶進行消化，37℃水浴約30min后冰浴，采用碘化丙錠（PI）一步插入性DNA定量熒光染色。每一份樣品中約加入DNA染液1.0mL，放入4℃避光染色30min，過濾后制成單細胞懸液，上機檢測細胞周期，同時設二抗的本底對照和陰性對照。使用Expo32 ADC進行免疫熒光數據分析，Muticycle AV分析軟件分析細胞周期。

1.3 統計學分析

數據應用SPSS13.0統計軟件包進行統計學分析。樣本均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，顯著性水平α=0.05。

2 結 果

2.1 腫瘤生長抑制情況

所有裸鼠接種細胞48h左右接種部位均可觸及米粒大小結節，約5d后明顯成瘤，測量瘤體積；空白對照組及各治療組在用藥第1周內，瘤體生長均較緩慢；其后空白對照組移植瘤瘤體呈現迅速生長，而治療組移植瘤瘤體生長仍較緩慢，以高劑量VM-26組最為顯著，其次為聯合用藥組；具體各組移植瘤情況見表1。

2.2 流式細胞術檢測腫瘤細胞周期及凋亡情況

流式細胞儀分析結果顯示G2/M期細胞的阻滯在不同劑量VM-26組而有所不同，低劑量VM-26組細胞阻滯作用很輕微，與空白對照組相比無統計學差異（P＞0.05）；相比之下，高劑量VM-26組可見明顯的G2/M期細胞阻滯，與空白對照組相比具有統計學差異（P＜0.05）；結果提示VM-26對胃癌細胞的阻滯作用是劑量依賴性的。本實驗還觀察到沙利度胺組也有一定程度的G2/M期細胞阻滯作用，與空白對照組相比同樣具有統計學意義（P＜0.05）。而聯合用藥組G2/M細胞的阻滯作用最為顯著，與空白對照組及沙利度胺組比較均有統計學意義（P＜0.05）；結果表明在降低替尼泊苷的劑量之后聯合沙利度胺對胃癌細胞的生長仍有明顯的抑制作用，對G2/M期細胞阻滯表現出協同作用；同時可見明顯的凋亡峰，提示二者的聯合可以分別通過不同的途徑誘導細胞的凋亡（表2）。

3 討 論

VM-26和沙利度胺均可阻滯腫瘤細胞的生長，但作用的細胞周期不同。沙利度胺對腫瘤細胞的阻滯則主要表現在G1期。體外研究顯示VM-26可將口腔鱗癌細胞和人胃癌細胞阻滯于G2/M期[4,5]，同時認為細胞周期的這種變化與細胞的凋亡有著十分密切的聯系。羅執芬等[6]報道在相同摩爾濃度下，VM-26對胃癌BGC-823細胞的抑制率是依托泊甙的5倍以上。馬望等[7]報道VM-26和奧沙利鉑聯合用藥對抑制胃癌BGC-823細胞生長有協同作用，并且VM-26與5-氟尿嘧啶聯合用藥對抑制胃癌BGC-823細胞生長有相加作用。近年來，沙利度胺在實體腫瘤治療中的作用越來越受到人們的關注。多項研究顯示[8]沙利度胺可以下調腫瘤細胞表面的VEGF和bFGF水平，抑制腫瘤血管形成，起抗腫瘤作用。此外沙利度胺還誘導腫瘤細胞凋亡，誘導IL-2的產生，提高NK細胞對腫瘤的殺傷作用和抑制TNF-A的合成以及提高CD8+T細胞的增殖等作用，并且沙利度胺和化療的聯合已經在臨床治療胃癌取得了不錯的成績[9]。

本實驗我們應用替尼泊苷聯合沙利度胺作用于人胃腺癌移植瘤，流式細胞儀分析顯示，高劑量替尼泊苷組和聯合用藥組S期細胞比例不同程度下降，多數腫瘤細胞阻滯于G2期，而沙利度胺單藥組及低劑量VM-26單藥組與空白對照組相比S期細胞比例也有所下降，并且聯合用藥組G2/M細胞的阻滯作用最為顯著。結果表明替尼泊苷聯合沙利度胺對G2/M期細胞阻滯表現出協同作用，從而對誘導胃癌細胞凋亡起到協同作用，為臨床胃癌的治療提供了新的思路與理論支持。

[1] 孫燕 石遠凱.臨床腫瘤內科手冊[M].5版.北京:人民衛生出版社, 2007:476.

[2] 秦叔逵,龔新雷.晚期胃癌化療的現狀和新進展[J].臨床腫瘤學志,2006,11(9):641-652.

[3] Wang M,Ming G,Wei H,et al.Oxaliplatin and teniposide can inhibit the proliferation and induce the apoptosis of gastric cancer cell line BGC-823 synergistically[J].Chinese-German J Clin Oncol, 2010,3(9): 149-152.

[4] 羅執芬,周云,劉明月.替尼泊苷對胃癌細胞BGC-823體外增值的影響[J].鄭州大學學報(醫學版),2007,42(3):483-484.

[5] Gao S,Yang XJ,Zhang WG,et al.Mechanism of thalidomide to enhance cytotoxicity of temozolomide in U251-MG glioma cells in vitro[J].Chin Med J(Engl),2009,122(11):1260-1266.

[6] 羅執芬,周云.替尼泊甙和依拓泊甙對胃癌細胞體外抑瘤作用比較[J].中國實用醫刊,2007,34(11):7-9.

[7] 馬望,高明.奧沙利鉑聯合替尼泊苷抑制胃癌BGC-823細胞生長和誘導凋亡的作用[J].腫瘤,2010,30(1):31-35.

[8] Kakeji Y,Koga T,Sumiyoshi Y,et al.Clinical significance of vascular endothelial growth factor expression in gastric cancer[J]. J Exp Clin Cancer Res,2002,21(1): 125-129.

[9] 趙福友,王子安,鄭榮生.沙利度胺聯合化療治療晚期胃癌的隨機對照研究[J].中華全科醫學,2010,98(9):1089-1091.

R735.2

B

1671-8194（2013）23-0058-02

河南省醫學科技攻關基金資助(項目編號：201203055)

*通訊作者：E-mail：15231135369@139.com