三妙丸類方及川牛膝對急性痛風性關節炎大鼠炎癥反應的作用機制研究

單 瑋 闕華發

(上海中醫藥大學附屬龍華醫院中醫外科，上海，200032)

流行病學研究發現，痛風已成為一種遍布全球的多發病、常見病，在我國痛風是僅次于糖尿病的代謝病，對患者的生命健康，生活質量的危害較大［1－2］。目前國內外尚無根治痛風的辦法。現今治療痛風的目的是控制痛風性關節炎急性發作、降低血清尿酸水平，以預防尿酸鹽沉積導致的關節破壞及腎臟損害。對急性痛風性關節炎的處理，西醫首選的藥物仍然是秋水仙堿與非甾體類解熱鎮痛藥，這兩類藥物具有起效快，療效顯著的特點，但其嚴重的毒副反應限制了臨床運用。中醫藥治療痛風性關節炎具有臨床療效肯定，毒副反應小，可以長期服用的特點，在痛風性關節炎的防治方面具有西醫西藥不可替代的優勢。痛風性關節炎屬于中醫“濕熱痹”范疇，病機關鍵在于濕熱痹注，臨床治療采用清熱祛濕，解毒消腫，化瘀止痛為大法。金元時期的朱丹溪，創制上中下通用痛風方，用蒼術、黃柏(二妙散)為基本組方治之，其治法對后世啟迪深遠。現代臨床多用二妙丸加川牛膝組成的三妙丸為基礎，治療痛風性關節炎取得良好療效。為了探討三妙丸類方與引經藥川牛膝在調控痛風性關節炎中的作用機理，我們進行了以下實驗研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 雄性SPF 級Wistar 大鼠70只，2月齡，體質量180～220 g，平均(203.00±10.73)g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供(SCXK(滬)2007－0005)。飼養于上海中醫藥大學附屬龍華醫院動物實驗中心，在18～28℃，相對濕度40%～70%的屏障系統喂養，正常飼料和飲水，分籠飼養，每籠5只。

1.1.2 實驗藥物及試劑 中藥飲片:川牛膝、蒼術、黃柏，均由龍華醫院中藥房提供并制成水煎劑。其中二妙丸組由蒼術30 g、黃柏20 g組成，減壓濃縮至含生藥0.5 g/mL，人鼠等效劑量為4.41 g/kg;三妙丸低劑量組由蒼術30 g、黃柏20 g、川牛膝10 g組成，減壓濃縮至含生藥1.08 g/mL，人鼠等效劑量為5.29 g/kg;三妙丸高劑量組由蒼術30 g、黃柏20 g、川牛膝30 g組成，減壓濃縮至含生藥1.44 g/mL，人鼠等效劑量為7.05 g/kg;川牛膝低劑量組由川牛膝10 g組成，減壓濃縮至含生藥0.18 g/mL，人鼠等效劑量為0.89 g/kg;川牛膝高劑量組由川牛膝30 g組成，減壓濃縮至含生藥0.54 g/mL，人鼠等效劑量為2.64 g/kg。尿酸鈉結晶:美國Sigma－Aldrich 公司提供，批號:BCBC2022。

1.2 方法

1.2.1 痛風性關節炎動物模型建立 參照文獻方法［3－4］，將1 g 尿酸鈉結晶加入40 mL 生理鹽水，再加10 mL 吐溫80，加溫攪拌，制成濃度為20 mg/mL的尿酸鈉溶液。用4.5號注射針在大鼠右側踝關節背側從45°方向插入右側脛骨肌鍵內側，將50μL 尿酸鈉溶液注入到右側踝關節腔，形成痛風性關節炎大鼠模型。

1.2.2 動物分組 70只大鼠隨機取10只作為正常組，其余60只大鼠建立模型后隨機分為模型組、二妙丸組、三妙丸低劑量組、三妙丸高劑量組、川牛膝低劑量組、川牛膝高劑量組，每組10只。

1.2.3 給藥方法 各組于造模后次日開始給藥，正常組和模型組予生理鹽水灌胃每日1次，每次2 mL;各藥物干預組分別予相應的中藥煎劑灌胃每日1次，每次2 mL。

2 觀察指標

2.1 急性痛風性關節炎大鼠右踝關節腫脹度 用容積法測定大鼠踝關節的周徑［5］。試驗前在每只大鼠右側踝關節處作標記，按容積法測定各鼠右側足踝容積2次，取2次的容積平均值作為各鼠造模前容積，確保各組數據無統計學意義。造模后6 h、24 h、48 h、72 h用上述方法測量各組大鼠右足踝容積，取平均值作為記錄數據。

2.2 急性痛風性關節炎大鼠滑膜組織NF－κB P65 表達水平、TNF－α、IL－6、IL－8的水平 用藥3天后，各組大鼠以鹽酸氯胺酮(100 mg/Kg)麻醉，剪下大鼠右側踝關節，取大鼠右踝關節滑膜組織，放入凍存管內，分別粘貼標記，用ELISA 法檢測TNF－α、IL－6、IL－8的水平，用Western blot 法檢測NF－κB P65 表達水平。

2.3 急性痛風性關節炎大鼠滑膜組織的形態學檢查 取大鼠滑膜組織放入清潔EP 管，10%福爾馬林浸泡，固定保存，作組織病理用。急性痛風性關節炎大鼠滑膜組織進行鏡下組織形態學檢查，評分標準根據文獻改良［6－7］。1)血管充血:正常0分;輕度1分;中度2分;重度3分;2)炎細胞浸潤:正常0分;輕度1分;中度2分;重度3分;3)滑膜腫脹:正常0分;輕度1分;中度2分;重度3分;4)組織壞死:正常0分;輕度1分;中度2分;重度3分。

3 統計學方法

用SPSS 18.0 統計軟件進行統計學分析，數據均用均數±標準差表示。采用重復測量數據的方差分析和單因素方差分析，多組均數間的兩兩比較采用LSD－T 檢驗。

4 結果

4.1 急性痛風性關節炎大鼠右踝關節腫脹度 與正常組比較，模型組大鼠右踝關節腫脹度明顯高于正常組(P＜0.01)，說明模型復制成功;造模后72 h，與模型組比較，各藥物干預組大鼠右踝關節腫脹度低于模型組(P＜0.01，P＜0.05);其中，三妙丸高劑量組大鼠右踝關節腫脹度低于二妙丸組、川牛膝組、三妙丸低劑量組(P＜0.01);二妙丸組大鼠右踝關節腫脹度低于川牛膝組(P＜0.01)。造模后，除正常組大鼠外，其余各組大鼠出現明顯踝關節腫脹，于造模后6 h 出現炎癥反應，24 h 達到最高峰，48～72 h 有所減輕，見表1、圖1。

表1 各組大鼠右踝關節腫脹度測定結果

圖1 各組大鼠踝關節腫脹度測定結果

4.2 急性痛風性關節炎大鼠右踝關節滑膜組織NF－κB P65 蛋白表達水平 與正常組比較，模型組NF－κB P65 表達水平明顯高于正常組(P＜0.01);與模型組比較，各藥物干預組NF－κB P65 表達水平明顯降低(P＜0.01);其中三妙丸高劑量組NF－κB P65 表達水平低于二妙丸組、三妙丸低劑量組、川牛膝低劑量組、川牛膝高劑量組(P＜0.01);二妙丸組NF－κB P65 表達水平低于川牛膝低劑量組、川牛膝高劑量組(P＜0.01);川牛膝低劑量組與川牛膝高劑量組組間比較(P＞0.05)，見表2、圖2。

表2 各組大鼠踝關節滑膜組織NF－κB P65 Western blot 法檢測結果

圖2 各組大鼠踝關節滑膜組織NF－κB P65 Western blot 法檢測結果

4.3 急性痛風性關節炎大鼠右踝關節滑膜組織TNF－α，IL－6，IL－8的水平 與正常組比較，模型組大鼠滑膜組織TNF－α、IL－6、IL－8水平明顯高于正常組(P＜0.01);各藥物干預組滑膜組織TNF－α、IL－6、IL－8水平低于模型組(P＜0.01);其中三妙丸高劑量組滑膜組織TNF－α 水平低于二妙丸組、三妙丸低劑量組、川牛膝低劑量組、川牛膝高劑量組(P＜0.01);三妙丸低劑量組與三妙丸高劑量組滑膜組織IL－6、IL－8水平低于二妙丸組、川牛膝低劑量組、川牛膝高劑量組(P＜0.01)，三妙丸低劑量組與三妙丸高劑量組組間比較(P＞0.05);二妙丸組滑膜組織TNF－α、IL－6、IL－8水平低于川牛膝低劑量組、川牛膝高劑量組(P＜0.01);川牛膝低劑量組與川牛膝高劑量組組間比較(P＞0.05)，見表3。

表3 各組大鼠滑膜組織TNF－α、IL－6、IL－8檢測結果

表4 各組大鼠踝關節組織病理學積分

4.4 急性痛風性關節炎大鼠右踝關節滑膜組織病理學形態組織病理學觀察:光鏡下觀察可見正常滑膜光滑而有光澤，半透明，滑膜由2～4 層上皮樣結締組織細胞構成，無基膜，細胞間有少量結締組織和纖維，滑膜組織無炎性細胞浸潤、滑膜細胞增生和毛細血管充血、水腫;模型組滑膜充血、水腫，炎細胞浸潤，滑膜細胞增生;與正常組比較，模型組滑膜組織病理學積分高于正常組(P＜0.01);與模型組比較，各藥物干預組滑膜組織病理學積分低于模型組(P＜0.05);其中川牛膝高劑量組滑膜組織病理學積分低于二妙丸組、三妙丸組、川牛膝低劑量組(P＜0.05)，見表4、圖3、圖4、圖5。

圖3 正常組大鼠滑膜組織形態(×100)

圖4 模型組大鼠滑膜組織形態(×100)

圖5 川牛膝高劑量組大鼠滑膜組織形態(×100)

5 討論

急性痛風性關節炎屬于中醫“濕熱痹”范疇，其發病以脾腎兩虛為本，濕濁、痰瘀、熱毒為標，屬正虛邪實之證［8－12］。病位屬下部，病機關鍵在于濕熱痹注。針對濕、熱、痹為痛風性關節炎發病的關鍵因素，臨床治療采用清熱祛濕，解毒消腫，化瘀止痛為法，常用清熱祛濕的三妙丸類方加減治療，取得顯著的療效。三妙丸出自明代虞摶所著的《醫學正傳》，是由《丹溪心法》二妙丸加牛膝而成。方中蒼術燥濕健脾、祛風濕;黃柏清熱燥濕、瀉火解毒;牛膝活血通經、補肝腎、強筋骨、利水通淋、引藥下行［13－15］;三藥合用，共奏清熱活血利濕之功。

實驗結果顯示:在模型建立后6h、24h、48h、72h，各藥物干預組大鼠踝關節腫脹度均明顯低于模型組(P＜0.01 或P＜0.05)，說明二妙丸、三妙丸、川牛膝具有降低急性痛風性關節炎大鼠關節腫脹度的作用;其中三妙丸降低急性痛風性關節炎大鼠關節腫脹度的療效尤為顯著，其理論基礎在于三妙丸是在二妙丸的基礎上加入川牛膝而成，川牛膝除了具有化瘀通絡、補益肝腎功效外，還有“引藥下行”的作用。《寒溫條辨》記載“牛膝，生用其性下走如奔，破血癥，通經閉，引諸藥下行”;《本經逢原》亦云“丹溪言牛膝能引諸藥下行，筋骨痛風在下者宜之。”因此，在二妙丸中加入引經藥川牛膝可以加強二妙丸的藥效。在抑制踝關節腫脹度方面，二妙丸與川牛膝具有藥效的協同及增效作用。實驗結果顯示隨著三妙丸中牛膝劑量的增加，其抑制踝關節腫脹度的作用增強，具有一定的量效正相關關系。

現代醫學認為，痛風性關節炎急性發作是尿酸鈉鹽結晶在關節及關節周圍結締組織以結晶形式沉積引起的急性炎癥反應，是PMN 介導的炎癥。目前研究發現，NF－κB 是急性炎癥反應的中樞環節，NF－κB的不適當激活是引起過度炎癥反應和炎癥損傷的關鍵因素。活化的NF－κB 可高效誘導多種細胞因子，如TNF－α、IL－1β、IL－6、IL－8、粒細胞、巨噬細胞集落刺激因子等。同時，對參與炎癥反應放大與延續(即級聯瀑布效應)的多種酶的基因表達具有重要的調控作用。TNF－α、IL－1β、IL－6、IL－8作為炎癥趨化因子和激活因子，在痛風性關節炎的發生、發展過程中起重要作用［16］，它們與疾病的進程及預后密切相關［17－18］。阻斷NF－κB 活性，從而下調眾多的炎性細胞因子表達成為目前預防、治療痛風性關節炎的希望和策略。實驗結果顯示:模型組NF－κB P65 表達水平明顯高于正常組，說明大鼠致炎后在局部組織有高表達的NF－κB P65 存在，NF－κB P65 參與了炎癥反應;各藥物干預組NF－κB P65 表達水平低于模型組(P＜0.01)，說明二妙丸、三妙丸、川牛膝通過下調NF－κB P65 表達水平，抑制NF－κB 活性，減輕局部炎癥，發揮抗炎作用。其中三妙丸下調NF－κB P65 表達水平尤為顯著，并且隨著三妙丸中牛膝劑量的增加，其下調NF－κB P65 表達水平的作用增強。三妙丸抗炎作用的增強，機制可能在于在二妙丸中加入牛膝后，增強了二妙丸的抑制NF－κB 活性的作用。通過對滑膜組織細胞因子的檢測，發現二妙丸、三妙丸、川牛膝具有降低滑膜組織的IL－6、IL－8、TNF－α 水平的作用，并且隨著三妙丸中引經藥川牛膝劑量的增加，其抑制細胞因子的作用增強;說明在引經藥牛膝的協同作用下，可以加強二妙丸抑制細胞因子的作用。

尿酸鈉鹽沉積是痛風性關節炎的特征性病理改變，病變主要發生在關節軟骨、滑膜、關節周圍軟組織等部位。可以看到滑膜組織炎細胞浸潤，尿酸鈉鹽沉積、組織局部壞死，間質膠原纖維樣變性，增生性變化，肉芽腫。本實驗在光鏡下觀察到，正常滑膜光滑而有光澤，半透明，滑膜組織無炎性細胞浸潤、細胞增生和毛細血管充血、水腫;模型組滑膜充血、水腫，炎細胞浸潤，滑膜細胞增生;二妙丸、三妙丸、川牛膝對滑膜炎癥反應較模型組均有不同程度減輕，以川牛膝高劑量組改善滑膜組織病理損害的作用尤為明顯。其理論基礎可能與牛膝具有補益肝腎、活血痛經的作用有關。

本研究結果為三妙丸類方及引經藥川牛膝治療急性痛風性關節炎提供了科學的依據，為中藥的引經研究提供新思路，對開發中藥靶向給藥體系奠定基礎。

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