MAT1基因及其蛋白在乳腺癌中的表達研究

趙劍鋒林麗娟陳金坤蔡清河林 銘

（1 莆田學院附屬醫院 普外科，福建 莆田 351100；2 莆田學院附屬醫院 胸外科，福建 莆田 351100）

MAT1基因及其蛋白在乳腺癌中的表達研究

趙劍鋒1林麗娟2陳金坤1蔡清河1林 銘1

（1 莆田學院附屬醫院 普外科，福建 莆田 351100；2 莆田學院附屬醫院 胸外科，福建 莆田 351100）

目的 探討MAT1基因及其蛋白在乳腺癌中的表達及意義。方法 選擇60例乳腺癌標本和20例正常乳腺標本，采用原位雜交和免疫組化SP法分別檢測乳腺癌組織中MAT1 mRNA及MAT1蛋白的表達水平，分析其與乳腺癌臨床病理學特征之間的關系。結果 38例（63.33%）MAT1 mRNA陽性，32例（53.33%）MAT1蛋白陽性，在乳腺癌組織中陽性表達率及表達強度顯著高于正常乳腺癌組織（P＜0.05）。不同臨床分期、組織病理學分級及有無淋巴結轉移MAT1 mRNA陽性率和MAT1蛋白陽性率比較，差異均有統計學意義（P＜0.05），MAT1 mRNA和MAT1蛋白表達分別與臨床分期正相關（P＜0.05）。結論 MAT1 mRNA及MAT1蛋白在乳腺癌組織中高表達，表達水平與臨床分期、組織病理學分級和淋巴結轉移密切相關，可作為判斷乳腺癌的進展、轉移的參考指標及治療的新靶點。

乳腺癌；MAT1；原位雜交技術；免疫組織化學

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，具有突出的侵襲性和轉移性，疾病進展迅速，是導致患者死亡的主要原因。MAT1（ménage à trois1）作為三聚體CAK激酶的重要組成部分，對CAK的活性起著“分子開關”的作用，因而在調節信號分子轉導、控制細胞周期的進程、影響細胞的增殖和凋亡等方面起著關鍵作用[1,2]。目前的研究表明MAT1存在于在前列腺癌、白血病及胰腺癌等多種惡性腫瘤組織中，國內對MAT1在乳腺癌組織中的表達及其意義的研究較少。本研究通過原位雜交技術和免疫組化技術檢測乳腺癌組織中MAT1 mRNA和MAT1蛋白的表達，探討其與臨床病理學特征的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇2008年1月至2011年在我院進行手術切除的乳腺浸潤性導管癌標本60例，患者來源均為女性，年齡30～72歲，中位年齡44歲，術前均未經化療或放療，術后病理學證實浸潤性導管癌。采用美國癌癥聯合委員會（AJCC）乳腺癌TNM分期臨床分期：Ⅰ期15例，Ⅱ期20例，Ⅲ期14例，Ⅳ期11例；組織病理學分級采用SBR分級：其中Ⅰ級17例，Ⅱ級20例，Ⅲ級23例；淋巴結轉移25例，無淋巴結轉移35例，雌激素受體（ER）陽性26例，孕激素受體陽性（PR）21例，表皮生長因子受體2（C-erbB-2）24例。另取30例正常乳腺病理活檢標本，患者來源均為女性。

1.2 主要試劑

抗人MAT1多克隆抗體、免疫組化SP通用試劑盒、地高辛標記原位雜交試劑盒、枸櫞酸鹽緩沖液、抗原修復液、DAB顯色劑購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 MAT1 mRNA和MAT1蛋白表達的檢測

標本經固定、石蠟包埋，連續切片，厚度4μm，常規脫蠟、水化，采用原位雜交法檢測MAT1 mRNA表達水平，操作嚴格按試劑盒說明進行，采用PBS代替寡核苷酸探針作為陰性對照；采用抗人MAT1多克隆抗體經免疫組化SP法檢測MAT1蛋白表達水平，操作嚴格按試劑盒說明進行，常規顯色、復染、脫水、透明。以PBS代替一抗作為陰性對照。

1.4 結果判定

原位雜交陽性和免疫組化染色陽性表達均呈褐色或棕黃色。高倍鏡下隨機選擇5個不重疊視野，計數細胞數目，計算陽性細胞百分比，陽性細胞占比＜10%為陰性（ā）；陽性細胞占比為10%～30%為低表達（+）；陽性細胞占比30～70%為中度表達（++）；陽性細胞占比＞70%為高表達（+++）。

1.5 統計學處理

采用SPSS18.0軟件進行統計學分析，計數資料采用卡方檢驗及Fisher’s確切概率法，等級相關性采用Spearman等級相關分析，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 MAT1 mRNA和蛋白在乳腺癌組織中的表達

MAT1主要定位于細胞漿，38例（63.33%）MAT1 mRNA陽性，32例（53.33%）MAT1蛋白陽性，在乳腺癌組織中陽性表達率及表達強度顯著高于正常乳腺癌組織（P＜0.05），見表1

表1 MAT1 mRNA和蛋白在乳腺癌組織中的表達[n（%）]

表2 MAT1 mRNA和蛋白在乳腺癌組織中表達與臨床病理特征的關系[n（%）]

2.2 MAT1 mRNA和蛋白在乳腺癌組織中表達與臨床病理特征的關系

不同臨床分期、組織病理學分級及有無淋巴結轉移中MAT1 mRNA及其蛋白陽性率比較，差異均有統計學意義（P＜0.05），MAT1的表達與年齡、ER陽性、PR陽性、C-erbB-2陽性無關（P＞0.05），見表2。經Spearman等級相關分析MAT1 mRNA和MAT1蛋白表達分別與臨床分期正相關（r=0.461，0.408，P＜0.05）。

3 討 論

人類MAT1（ménage à trois 1）基因是一個新近發現的基因,位于染色體14q23，全長1.28kb，編碼309個氨基酸，其蛋白相對分子質量36KD[1-3]。作為細胞周期依賴性蛋白激酶激活激酶（cyclin—dependent kinase—activating kinase，CAK）重要組成部分，MAT1與CDK7和cyclin H共同組成了Cdk7/cyclin H/MAT1三聚體復合物，通過調節CAK的活性，影響CDK1、CDK2、CDK4、RNA Pol II和細胞周期蛋白等底物的磷酸化，進而影響了抑癌基因p53、pRb的磷酸化。迄今為止，所有已發現的CAK功能中，包括細胞周期的調節、轉錄和分化都離不開MAT1的調控，因此MAT1被認為對CAK的活性起著“分子開關”的作用[3-8]。MAT1基因最早克隆于鼠的乳腺腫瘤細胞中，近來發現，在骨肉瘤、前列腺癌、白血病及胰腺癌的相關實驗中也發現MAT1在細胞周期調控和凋亡程序中起著重要的作用[9-11]。在腫瘤細胞中MAT1表達顯著上調，劉建平等實驗提示在胰腺癌組織中MAT1的表達顯著高于胰腺良性腫瘤和正常組織，而且MAT1的表達主要在細胞質，部分在核膜[11,12]。我們的實驗通過原位雜交技術和免疫組化SP法顯色后顯示，MAT1定位于細胞漿內，而核仁不染色。比較乳腺癌和正常乳腺組織MAT1 mRNA和蛋白陽性率顯示，正常乳腺組織細胞中可檢出MAT1 mRNA及其蛋白，但陽性率和表達強度遠低于乳腺癌組，表明乳腺癌組織中MAT1的表達呈高表達，通過原位雜交技術檢測MAT1 mRNA的陽性率略高于免疫組化SP法檢測的MAT1蛋白的陽性率，表明采用基因檢測技術能更敏銳的反應MAT1的表達情況。

細胞的增殖、凋亡由細胞周期調控，腫瘤則是一類細胞周期病，腫瘤細胞表現為增殖多、凋亡少，快速的生長并不斷侵襲周圍組織，發生轉移。CAK是主要的細胞周期調控因子，與不同的周期蛋白結合激活，推動細胞周期的階段進程。MAT1則是CAK重要的組成部分直接控制CAK的活性，從而影響細胞周期進程[2,5,6]；體外實驗轉染反義MAT1基因可使胰腺癌細胞出現明顯的G1期阻滯，小干擾RNA轉染胰腺癌Capan-2細胞沉默MAT1基因，對胰腺癌細胞生長具有抑制作用[12]。本研究結果顯示，MAT1mRNA和MAT1蛋白表達與年齡、ER陽性、PR陽性、C-erbB-2陽性無關，與臨床分期、組織病理學分級及淋巴結轉移密切相關，并且與臨床分期呈正相關，均表明MAT1的表達與乳腺癌細胞侵襲和轉移能力有關。乳腺癌進展程度越嚴重，分化程度越低腫瘤細胞增殖越明顯，浸潤范圍越大，侵襲力越強，MAT1的高表達可能參與促進乳腺癌腫瘤細胞的侵襲、浸潤。乳腺癌是轉移性很強的惡性腫瘤，淋巴結轉移和遠處轉移的風險高，有淋巴結轉移的乳腺癌組織中MAT1陽性率顯著高于無淋巴結轉移的組織。MAT1的高表達可促進細胞由G1期向S期的轉化[13]，因此在調控細胞周期中可能促進腫瘤細胞的增殖，增強腫瘤細胞的侵襲力，減弱周圍組織抵御侵襲的能力，促進腫瘤細胞浸潤，通過淋巴、血液發生轉移。因此，檢測MAT1表達尤其是MAT1 mRNA的表達將有助于了解乳腺癌的進展程度，判定轉移和復發的風險，為乳腺癌侵襲、轉移趨勢的判斷提供參考，抑制MTA1表達可能成為乳腺癌治療和預防復發的新途徑。

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Research of the Expression of Molecular Switch MAT1 Gene and its Protein in Breast Cancer

ZHAO Jian-feng1, LIN Li-juan2, CHEN Jin-kun1, CAI Qing-he1, LIN Ming1
(1 Department of General Surgery, The Affiliated Hospital of Putian College, Putian 351100, China;2 Department of Thoracic Surgery, The Affiliated Hospital of Putian College, Putian 351100, China)

Objective To investigate the expression of molecular switch MAT1 gene and its protein in breast cancer. Methods 60 cases of breast cancer specimens and 20 normal breast specimens, using in situ hybridization and immunohistochemical SP method was used to detect breast cancer tissues MAT1 MAT1 mRNA and protein levels, analyze its relationship with clinicopathological features of breast cancer relationships. Results 38 cases(63.33%) of MAT1 mRNA-positive, 32 cases(53.33%) of MAT1 protein , MAT1 mRNA-positive and MAT1 protein positive expression rates in breast cancer were significantly higher than normal breast tissue (P＜0.05). The differences of MAT1 mRNA-positive and MAT1 protein positive rates among different clinical stages, different histological grade and lymph node metastasis were statistically significant (P＜0.05), MAT1 mRNA and protein expression of MAT1 were positively correlated with clinical stage (P＜0.05). Conclusion MAT1 mRNA and MAT1 protein is highly expressed in breast cancer tissues, expression levels with clinical stage, histological grade and lymph node metastasis, could be used as breast cancer progression and metastasis reference index and a new therapeutic target.

Breast cancer; MAT1; Situ hybridization; Immunohistochemistry

R737.9

B

1671-8194（2013）34-0001-03

福建省自然科學基金項目（2006J0384）

*通訊作者：E-mail：249098134@qq.com.