母體來源人胎盤間充質細胞的分離培養及其分化能力的研究

馬曉娜 劉 婷 金毅然 王立斌 魏 軍*

（寧夏醫科大學總醫院寧夏人類干細胞研究所，寧夏 銀川 750004）

母體來源人胎盤間充質細胞的分離培養及其分化能力的研究

馬曉娜 劉 婷 金毅然 王立斌 魏 軍*

（寧夏醫科大學總醫院寧夏人類干細胞研究所，寧夏 銀川 750004）

目的 探討胎盤母體來源間充質細胞的分離、培養方法及其向脂肪和成骨誘導分化潛能。方法 采用酶消化獲得母體來源胎盤間充質干細胞；體外擴增后，利用流式細胞儀檢測其表面標志物；進行誘導分化后，采用油紅O及茜素紅染色鑒定其向脂肪和成骨誘導分化潛能。結果 體外培養的母體來源胎盤間充質干細胞呈長梭形,細胞形態均一；細胞表面標志鑒定：CD73、CD90和CD105呈陽性表達，而CD14、CD34、CD45和HLA-DR呈陰性表達；細胞誘導分化后，經油紅O、茜素紅染色證實其可分化為脂肪細胞和成骨細胞。結論 建立了母體來源胎盤間充質干細胞的分離培養方法；證實其具有成脂、成骨分化潛能，有望成為細胞治療及組織工程更為理想的種子細胞。

母體來源胎盤間充質細胞；脂肪細胞；成骨細胞

間充質細胞（mesenchymal stem cells,MSCs）是來源于成熟組織中的多能干細胞，具有高度自我更新能力和多向分化潛能，是細胞移植和組織工程的新型種子細胞，其中研究最為廣泛的MSCs來源于骨髓[1]，與骨髓取材相比胎盤在胎兒娩出后即成為“廢棄”物，取材方便，同時胎盤易于分離，征得同意后不涉及倫理道德問題，因而可能成為一種理想的再生醫學資源。

本文利用產婦生產后的胎盤，分離出與產婦本人組織配型相同的間充質細胞，并通過定向誘導分化確定其多能性，將使產婦保存其自身的干細胞成為可能。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

胎盤組織取自寧夏醫科大學總醫院產科臨床足月剖宮產胎盤，產婦及其家屬知情同意，并簽署知情同意書。

1.2 主要儀器及試劑

流式細胞儀（BD），倒置顯微鏡（Olympus） ，鼠抗人單克隆抗體IgG2a-FITC、IgG1-PE、CD73- PE、CD105-PE、CD14-FITC、CD34-FITC、CD45-FITC、CD90-FITC和HLA-DR-FITC（BD），FBS、L-DMEM，collagenase A、DNase I（ROCHE），脂肪細胞誘導分化培養基（DMEM 加入10%FBS、10μg/mlinsulin、1uM dexamethasone、1mM 3-isobutyl-1-methylxanthine、60uM indomethacin）；成骨細胞誘導分化培養基（DMEM 加入10%FBS，100nM dexamethasone、10mM beta-glycerophosphate、0.05mM ascorbic acid-2-phosphate）。

2 實驗方法

2.1 母體來源胎盤間充質細胞的分離提取

剪取胎盤母體側蛻膜組織，PBS漂洗數次后，將組織剪碎轉于50mL離心管中，加入0.1%collagenase A在37℃水浴消化2h，消化后的細胞懸液過100目細胞篩網，離心后重懸于培養基中，培養48h后換液。當細胞融合率達80%時消化傳代。

2.2 細胞生長曲線的測定

設定檢測時間點為：0h、12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h、108h、120h。選取第三代對數期的細胞，以1×105個/孔的密度接種于96孔板中，設6個平行孔。MTT測定細胞生長曲線。

2.3 流式細胞儀檢測細胞表面標志物的表達

選取第三代細胞，以細胞濃度為1×107/mL，0.1mL/管，分別加入鼠抗人單克隆抗體 CD73-PE、CD90-PE、CD105-PE、CD14-PE、CD34-FITC、CD45-PE、HLA-DR-PE、IgG2a-FITC、IgG1-PE，流式細胞儀檢測。

2.4 母體來源胎盤間充質細胞向脂肪和向成骨細胞誘導分化及鑒定

選取第三代細胞，當細胞融合率達80%時將培養基更換為脂肪細胞誘導分化培養基，每3d換液，誘導12d后油紅O染色鑒定。選取第三代細胞，當細胞融合率達80%時將培養基更換為成骨細胞誘導分化培養基，每3d換液，誘導14d后茜素紅染色鑒定。

3 結 果

3.1 母體來源胎盤間充質細胞形態學特征

原代細胞接種48h換液后僅有少量貼壁細胞生長，10d后可見許多細胞克隆，細胞呈漩渦狀生長，細胞絕大多數為長梭形成纖維樣細胞，當細胞融合率達到80%時，按1∶3消化傳代，2d后細胞密度達80%。傳代至第8代可見細胞形態均一，狀態良好（圖1）。

3.2 母體來源胎盤間充質細胞細胞生長曲線測定

對第三代細胞的生長曲線進行了觀察，細胞傳代后潛伏期約為24～36h，36～72h細胞增殖較快進入對數增殖期，72h后進入平臺期（圖2）。

3.3 母體來源胎盤間充質細胞表面抗原表達

流式細胞儀檢測母體來源間充質細胞第三代細胞表面抗原，結果顯示高表達CD73、CD90和CD105，CD14、CD34、CD45和HLA-DR呈陰性，具有典型的間充質干細胞表面標志（圖3）。

圖1 母體來源胎盤間充質細胞的形態特征

圖2 母體來源胎盤間充質細胞生長曲線

圖3 母體來源胎盤間充質細胞表面標志分子檢測結果

圖4 母體來源胎盤間充質細胞向脂肪和成骨細胞定向誘導分化鑒定結果

3.4 母體來源胎盤間充質細胞向脂肪和成骨細胞定向誘導分化

加入脂肪誘導培養基后，細胞停止增殖，體積變大，逐漸從長梭形變為方形或橢圓形，10d左右細胞內出現脂肪滴，誘導12d后經油紅O染色可見細胞內紅色脂滴。表明按母體來源胎盤間充質細胞有向脂肪細胞誘導分化的潛能（圖4 A）。

加入成骨誘導培養基后可見細胞呈漩渦狀重疊生長，逐漸聚集成團，誘導14d后經茜素紅染色可見多個分布不均，大小形態各異的紅色鈣結節。表明按母體來源胎盤間充質細胞有向成骨細胞誘導分化的潛能（圖4 B）。

4 討 論

胎盤作為胚胎發育中維系母體和胎兒氧氣及營養物質交換的重要暫時性器官，是一種由起源于胚胎滋養層和胚外中胚層的胎兒組織與母體子宮蛻膜組織共同組成的器官，其細胞組成包含了較為原始的胚胎干細胞和活化的母體干細胞。美國學者KvainaiA[2]發現胎盤中含有豐富的間充質細胞，提出了將胎盤作為再生組織工程的細胞資源的設想。In’t Anker等人的研究分別從胎盤的胎兒側和母體側組織分離出間充質干細胞，鑒定了所得的間充質干細胞分別為胎兒來源和母體來源的干細胞[3]，胎盤作為分娩后的廢棄物，在材料獲得方面更加方便，對其研究不會涉及倫理道德問題，可能成為組織工程新的細胞來源。

該研究結果顯示，從胎盤中分離提取到的母體來源間充質細胞有很強的增殖能力，流式細胞儀檢測結果表明其抗原標具有典型的間充質干細胞表面標志，且培養的細胞具有成脂和成骨分化能力，經多次傳代后仍狀態良好[4-5]。分離出的母體來源的間充質細胞是與產婦本人組織配型相同的間充質干細胞，將使產婦保存其自身的干細胞成為可能，同時可以為組織工程提供潛在的理想種子細胞。

[1] 羅飛.間充質干細胞在組織工程中的研究進展[J].第三軍醫大學學報,2003,25(2):176.

[2] Kaviani A,Perry TE,Barnes CM,et al.The placenta as a cell source in fetal tissue engineering [J].J Pediatric Surgery,2002,37(7):995-999.

[3] In’t Anker PS,Scherjon SA,Kleijburg-van der KeurC,et al.Isolation of mesenchymal stem cells of fetal ormaternal origin from human placenta[J].Stem Cells,2004,22(7):1338-1345.

[4] Yen BL,Huang HI,Chien CC,et al.Isolation of multipotent cells from human term placenta[J].Stem Cells,2005,23(1):3-9.

[5] Kaviani A,Perry TE.The placenta as a cell source in fetal tissue engineering[J].J Pediatric Surg,2002,37(7):995-999.

Isolation and Culture of Human Maternal Placenta Original Mesenchymal Stem Cells and Identification of its Differentiated Potential into Adipocytes and Osteoblasts

MA Xiao-na, LIU Ting, JIN Yi-ran, WANG Li-bin, WEI Jun*
(General Hospital of Ningxia Medical University, Ningxia Human Stem Cell Institute, Yinchuan, 750004, China)

Objective To search the suitable isolation and culture method of human maternal placenta original mesenchymal stem cells, and identify their differentiated potential into adipocytes and osteoblasts. Methods The mesenchymal stem cells were isolated from human maternal placenta by digested with collagenase; the expression of the specific cell surface marks was examined by flow cytometry; and the differentiated potential into adipocytes and osteblasts were identified by Oil Red O staining and Alizarlin Red staining. Results The human maternal placenta original mesenchymal stem cells exhibited homogeneous spindle shape; and they were positive expressed the cell surface marks of CD73, CD90and CD105, but they negative expressed the cell surface marks of CD14, CD34, CD45and HLA-DR. After induced in differentiation, the cells were positive stained by Oil Red O staining and Alizarlin Red staining, which were the markers of adipocyte and osteoblast. Conclusion The isolation and culture methods of human maternal placenta original mesenchymal stem cells were established; the differentiated potential of human maternal placenta original mesenchymal stem cells into adipocytes and osteoblasts were confirmed, which may provide an ideal alternative source for cell therapy and tissue engineering.

Human maternal placenta original mesenchymal stem cells; Adipocytes; Osteoblasts

R329

B

1671-8194（2013）34-0003-03

寧夏醫科大學面上項目資助（XM200940）

*通訊作者