曲安奈德鼻噴霧劑對鼻息肉組織中嗜酸性粒細胞及其趨化因子-2 表達的影響

劉新彥，霍占江，牛敬蓮，王 暉，劉曉燕，張廷錄

鼻息肉是在多種因素共同作用下鼻粘膜的慢性炎癥病變，病理表現為以嗜酸性粒細胞(EOS)為主的多種炎細胞浸潤［1］。嗜酸性粒細胞趨化因子(Eotaxin)是EOS 特異性趨化因子，通過與EOS上的CC 家族趨化因子受體3(CCR3)特異性結合，促進EOS 在氣道聚集及原位激活，從而引起氣道病變發生。有研究證實，鼻腔局部應用糖皮質激素能直接抑制鼻粘膜EOS 的活化，抑制鼻息肉生長，防止息肉術后復發的作用［2］。本文旨在研究鼻噴激素對鼻息肉組織中EOS 浸潤情況及Eotaxin-2 mRNA 表達的影響。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 選擇2011 年2 -8 月擬在我院接受鼻內鏡手術的鼻息肉患者24 例，隨機分成激素治療組和未治療組，每組12 例。激素治療組(男7例，女5 例，平均年齡38.14 歲)應用曲安奈德鼻噴霧劑噴鼻治療6 ～8 周(110 μg/次，1 次/d)。未治療組(男6 例，女6 例，平均年齡42.53 歲)未采取任何治療措施，只隨訪觀察。所有患者治療及觀察結束后，均于全麻下行經鼻內鏡鼻息肉摘除術，所有標本手術切除后分為2 份:1 份立即置于-196 ℃液氮冷凍后，置于-70 ℃冰箱中冰凍保存備用;1 份制作石蠟標本，并由2 位有經驗的病理醫師閱片，證實診斷。

1.2 方法 采用RT-PCR 方法分別檢測兩組鼻息肉組織中Eotaxin-2 mRNA 的表達水平。

1.2.1 引物設計與合成 參照GenBank 公布的Eotaxin-2 及β-actin 基因全長cDNA 序列的資料，借助于計算機軟件Primer Premier 5.0、Oligo 6.5各設計了2 條引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成。Eotaxin-2 正向引物:5p GGAGTGGGTCCAGAGGTACATTA 3p，反向引物:5p GCAGGTGGTTTGGTTGC 3p，擴增124 bp;內參照β-actin 正向引物:5p ATCATGTTTGAGACCTTCAACA 3p，反向引物:5p CATCTCTTGCTCGAAGTCCA 3p，擴增318 bp。

1.2.2 組織總RNA 的提取 取鼻息肉冰凍標本每組約50 mg，分別加TRIZOL 1 mL，4 ℃勻漿，搖勻，放置5 min。將各組消化好的組織裂解液吸到DEPC 處理過的1.5 mL離心管中，加新開的氯仿0.2 mL，輕搖15 s。室溫靜置2 ～3 min 后，4 ℃、12 000 r/min離心15 min。然后取上清無色水相(約0.6 mL)到離心管(DEPC 處理過)，加等體積異丙醇，室溫下靜置10 min。4 ℃、12 000 r/min 離心10 min。觀察總RNA 在管底的白色沉淀，棄去上清，75%乙醇1.0 mL 洗滌(用DEPC 水新配制)后，4 ℃、7 500 r/min離心5 min。去上清，用小Tip吸干液體。氣干沉淀5 ～10 min，DEPC 處理水20 ～30 μL加入，中槍打勻，55 ～60 ℃水浴10 min溶解總RNA，測光密度值。電泳:制備10 g/L瓊脂糖凝膠(Agarose gel，AG)，取5 μL PCR 擴增產物，加1 μL 上樣緩沖液混勻，加樣于凝膠載樣孔中，按5 ～10 V/cm 電壓梯度電泳25 ～30 min 后在紫外透射儀下觀察結果并照相記錄。

1.2.3 反轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR) 參照Fermentas 反轉錄試劑盒說明書進行實驗，反轉錄為cDNA。分別以不同患者鼻息肉組織cDNA 為模板，擴增Eotaxin-2 基因灰度掃描測定吸光度值。同樣反應條件下，擴增β-actin 作為陰性對照，計算相對吸光度。

1.3 統計分析 應用SPSS 13.0 軟件進行統計分析，計量資料以±s 表示，采用配對t 檢驗，P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組鼻息肉組織中Eotaxin-2 mRNA 表達水平 以β-actin 為參照，β-actin 條帶位于318 bp處，兩組均于124 bp 處出現特異性Eotaxin-2 基因條帶，灰度掃描測定吸光度，激素治療組Eotaxin-2 mRNA 吸光度值為(0.83 ± 0.09)，未治療組為(2.41 ±0.35)，激素治療組Eotaxin-2 mRNA 明顯低于未治療組(P ＜0.01)。見圖1。

圖1 Eotaxin-2 mRNA RT-PCR 產物電泳圖

2.2 HE 片中EOS 數量結果判定 HE 染色切片光鏡下觀察EOS，其胞漿染為粉紅色，細胞多呈圓形，體積較大，深藍色分葉或腎形雙核，在250 倍視野下每例標本選取5 個視野，計數EOS 細胞數，按EOS 細胞所占的百分率分為- ～+ + + (-:EOS 細胞≤5%;+:EOS 細胞占6% ～30%;+ +:EOS 細胞占31% ～50%;+ + +:EOS 細胞＞50%)。見表1，圖2、圖3。

表1 激素治療組與未治療組嗜酸粒細胞浸潤情況(例，%)

圖2 未治療組鼻息肉組織中EOS 浸潤情況(HE 染色×200)

圖3 治療組鼻息肉組織中EOS 浸潤情況(HE 染色×200)

3 討論

鼻息肉組織光鏡下表現為大量炎細胞浸潤，以EOS 為主，主要位于粘膜下、小血管周圍。武宇宏［3］在透射電鏡下觀察發現，鼻息肉組織存在大量活化期EOS，表現為包膜不完整且胞漿皺折增多，伸出偽足，偽足內可見顆?；蚩张荩鴮φ战MEOS 明顯減少，且均為靜息態EOS。鼻息肉中EOS 增多是Eotaxin 的趨化作用使EOS 發生選擇性聚集的結果。Eotaxin 是EOS 的高選擇性趨化因子，現已發現的成員有Eotaxin-1、Eotaxin-2、Eotaxin-3。其中，Eotaxin-2 是最主要的趨化因子，特異性趨化EOS，促使其向局部浸潤并激活。Schaefer 等［4］發現，Eotaxin-2 主要存在于鼻腔粘膜內皮細胞和上皮細胞，表明Eotaxin-2 從粘膜內側遷移到上皮層，引起EOS 為主的炎性反應疾病。Eotaxin-2 對鼻息肉的形成起著很重要的作用。

糖皮質激素鼻噴劑輔助治療鼻息肉已廣泛應用于臨床，并取得一定療效。2007 年歐洲鼻竇炎/鼻息肉診療指南將鼻噴激素作為治療鼻息肉的A類推薦［5］。王成碩等［6］對鼻息肉患者采用經鼻霧化吸入布地奈德混懸液1 周，視覺模擬評分發現，鼻塞、流涕、嗅覺喪失、頭痛癥狀均明顯減輕，鼻內鏡下見息肉體積明顯減小，且對腎上腺皮質功能無明顯影響［7］，提示短療程鼻霧化吸入激素治療鼻息肉安全有效。楊武等［8］采用免疫組化方法發現，全身應用激素后，鼻息肉組織中Eotaxin 表達顯著降低，表明糖皮質激素抑制Eotaxin 蛋白的表達，減少EOS 募集和活化。任秀敏等［9］研究發現，鼻息肉患者應用布地奈德鼻噴霧劑噴鼻治療4 ～6周后，Eotaxin 蛋白在鼻息肉組織中表達顯著降低。本研究結果表明，患者應用曲安奈德鼻噴霧劑治療6 ～8 周后，鼻息肉較前明顯減小，鼻堵癥狀緩解，鼻粘膜水腫減輕，嗅覺改善，術后病理切片顯示，EOS 浸潤較治療前明顯減少，且Eotaxin-2 mRNA 的表達明顯下調，與上述研究結果一致。表明鼻噴激素使鼻息肉組織中Eotaxin-2 蛋白的表達減少，進而減少了嗜酸粒細胞聚集和活化，使鼻息肉組織中的EOS 炎癥反應程度降低，提示阻止炎型遞質可能是治療鼻息肉的一種新思路。有關糖皮質激素具體抑制Eotaxin 蛋白表達的機制還需進一步研究。

［1］ Okano M，Fujiwara T，Haruna T，et al. Prostaglandin E(2)suppresses staphylococcal enterotoxin-induced eosinophilia-associated cellular responses dominantly through an E-prostanoid 2-mediated pathway in nasal polyps［J］. J Allergy Clin Immunol，2009，123(4):868-874.

［2］ Mygind N，Lund V.Intranasal corticosteroids for nasal polyposis:biological rationale，efficacy，and safety［J］. Treat Respir Med，2006，5(2):93-102.

［3］ 武宇宏.鼻息肉患者嗜酸性粒細胞及肥大細胞脫顆粒電鏡觀察［J］.河北北方學院學報(醫學版)，2005，22(1):7-11.

［4］ Schaefer D，Meyer JE，Pods R，et al. Endothelial and epithelial exoression of eotaxin-2(CCL24)in nasal polyps［J］.Int Arch Allergy Immnol，2006，140(3):205-214.

［5］ Fokkens W，Lund V，Mullol J.European position paper on rhinosinusitis and nasal polys 2007［J］.Rhinol Suppl，2007，(20):1-136.

［6］ 王成碩，婁鴻飛，婁瑋，等.短期布地奈德混懸液經鼻霧化治療慢性鼻竇炎伴鼻息肉的療效和安全性研究［J］.臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2012，26(8):347-350.

［7］ Lim M，Lew-Gor S，Darby Y，et al.The relationship between subjective assessment instruments in chronic rhinosinusitis［J］.Rhinology，2007，45(2):144-147.

［8］ 楊武，施唯，陳金輝，等. 全身應用激素對鼻息肉組織中Eotaxin 表達的影響［J］.臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2007，21(2):79-81.

［9］ 任秀敏，張燕，段乃超，等.局部應用糖皮質激素對鼻息肉組織中Eotaxin 蛋白的影響［J］.中國耳鼻咽喉頭頸外科，2009，16(8):451-454.