HPLC法測定人血漿中萬古霉素濃度及其藥動學研究

劉勝男，王佳慶，梅升輝，趙志剛

萬古霉素(Vancomycin)是一種三環糖肽類抗生素，其藥效較強，臨床上主要用于革蘭陽性菌，特別是敏感腸球菌和耐甲氧西林的葡萄球菌屬(MRSA)所致的嚴重感染，也可用于難辨梭狀芽胞桿菌等所致的系統感染和腸道感染。其主要的不良反應為腎毒性和耳毒性，嚴重者可導致腎衰竭和聽力喪失［1］。萬古霉素治療窗較窄，因此，根據患者的臨床情況，實施個體化給藥顯得尤為重要。國外指南認為［2］，檢測萬古霉素血藥濃度是反映藥物有效性最準確和最實用的方法，目前國內外很多醫療機構已經開展了該藥的治療藥物監測(TDM)。本文通過查閱文獻［3-5］，結合自身條件，建立一種快速測定法，并對健康志愿者的藥動學進行研究，為臨床安全、合理用藥提供參考。

1 材料

1.1 儀器 日本島津Class-VP高效液相色譜儀，包括LC-10AT輸液泵和SPD-10A紫外檢測器，色譜工作站軟件;高速離心機SCILOGEX D2012;渦旋混合器MVS-1;電子天平(Mettler AE163);超低溫保存箱(型號:MDFU32V);移液器 DRAGON MED。

1.2 試藥 注射用鹽酸萬古霉素(批號:10356018，規格 500 mg/瓶，Eli Lilly Japan K.K，Seishin Laboratories);萬古霉素標準品(批號:BCBD7944V:SIGMA);乙腈(色譜純，批號:112189，Fisher公司);磷酸 (分析純，批號:20110602，北京化工廠);磷酸二氫鉀(分析純批號，10017692，北京化學試劑公司);空白血漿為健康志愿者提供，來自北京血液中心;超純水。

2 方法與結果

2.1 受試對象 選擇3名健康男性志愿者，經心電圖、血壓、血尿常規及肝腎功能檢查均正常。受試者均了解所進行試驗的目的、方法和意義，并書面簽署知情同意書。本試驗方案通過首都醫科大學附屬北京天壇醫院倫理委員會討論通過。

2.2 色譜條件 Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)，流動相:乙腈-磷酸二氫鉀緩沖溶液(30 mM，pH 3.2)=10∶90(v/v)，流速 1.0 mL/min，進樣量 20 μL，紫外檢測波長236 nm，柱溫20℃。

2.3 標準溶液及沉淀劑的配制 精密稱取萬古霉素標準品20.0 mg，置于5 mL容量瓶中，加入30 mM的磷酸二氫鉀緩沖液至刻度，定容搖勻，配制成4 mg/mL的標準儲備液。取標準儲備液適量，分別用30 mM的磷酸二氫鉀緩沖液稀釋至50、100、200、500、1 000、2 000 μg/mL 的標準溶液，所有配制成的溶液置于4℃冰箱保存備用。

2.4 血清樣品的處理 取血漿180 μL，加入標準溶液 20 μL，搖勻，加入 10%高氯酸溶液 80 μL，渦旋1 min，12 000 r/min離心 10 min，取上清液20 μL進樣檢測。由藥物峰面積帶入外標峰面積的標準曲線求得萬古霉素的濃度。

2.5 標準曲線的繪制 取空白血漿180 μL，依次加入“2.3”項下萬古霉素標準溶液20 μL，配制成相當于血藥濃度為 5、10、20、50、100、200 μg/mL的血漿樣品，每一濃度為3樣本，按“2.4”項下方法操作。以外標法定量，以萬古霉素濃度(X)為橫坐標，血漿中萬古霉素峰面積(Y)為縱坐標，進行回歸運算，求得直線回歸方程為Y=3 126.8 X+1 3238(r=0.9 982，權重系數=1/x2)。結果表明，萬古霉素血藥濃度在5～200 μg/mL范圍內線性關系良好，定量下限為5 μg/mL。

2.6 專屬性試驗 取志愿者空白血漿200 μL，按“2.4”項下方法操作(不加標準溶液)，進樣20 μL，得色譜圖1A;取志愿者空白血漿 200 μL，按“2.4”項下方法操作(加標準溶液)，同法操作，得色譜圖1B;取健康志愿者注射給藥后的血漿樣品，同法操作，得色譜圖1C，結果萬古霉素的保留時間為13.5 min，且空白血漿中的內源性物質不干擾萬古霉素的測定。

圖1 血漿中萬古霉素色譜圖

2.7 相對回收率與精密度試驗 制備含萬古霉素濃度分別為5、201、160 μg/mL的血漿樣品各5份，按“2.2”項下操作，記錄萬古霉素峰面積。另配含萬古霉素濃度分別為5、20、160 μg/mL的標準溶液 200 μL各5份，加入10%高氯酸溶液80 μL混勻，渦旋混合 1 min，取上清液 20 μL 進樣，記錄萬古霉素峰面積。以每一濃度2種處理方法的峰面積比值計算絕對回收率，結果見表1。

表1 絕對回收率及精密度試驗結果(±s)

表1 絕對回收率及精密度試驗結果(±s)

理論值(μg/mL) 測得量(μg/mL) 日內RSD(%) 日間RSD(%) 絕對回收率(%)10 8.7±0.69 3.57 4.50 79.77 50 53.6±0.76 0.97 0.90 69.76 160 172.02±7.03 0.46 4.10 71.34

2.8 穩定性試驗 本文考察了低、中、高(10、50、160 μg/mL)3種濃度的萬古霉素血漿樣品處理后室溫放置10 h、-70℃冰箱冷凍8 d、反復凍融2次樣品的穩定性。見表2。結果表明，萬古霉素在室溫放置凍融狀態下穩定。

表2 萬古霉素穩定性考察(n=5)

2.9 實際樣品測定與藥動學研究 3名健康志愿者在1 h內靜脈滴注萬古霉素500 mg，分別于給藥前及靜脈滴注后 0.25、0.5、0.75、1、1.5、3、6、12 h時采集靜脈血約2 mL，置于肝素管中，3 500 r/min離心10 min，血漿于-20℃保存。并按上述方法進行實際樣品的測定，并以當日的標準曲線計算其濃度，同時配制低、中、高(10、50、160 μg/mL)3種濃度的QC樣品，每一濃度進行5個樣本分析，以確定當日結果的可靠性。應用本法測定了3名健康志愿者靜脈滴注萬古霉素500 mg后不同時刻的血藥濃度，平均藥-時曲線見圖2。

根據測定結果，利用藥動學軟件Phoenix1.1計算萬古霉素的主要藥動學參數，結果Cmax為21.13 μg/mL，tmax為 0.95 h，t1/2為 11.55 h，AUC0-∞為 218.00 μg·h/mL。

圖2 健康志愿者靜脈滴注萬古霉素500 mg后的平均藥-時曲線

3 討論

本試驗采用乙腈-30 mM磷酸二氫鉀緩沖液(10∶90，v/v)為流動相，在調整兩者比例時發現，內源性物質的出峰時間約為3 min，乙腈比例增加時，目標峰出峰時間提前，內源性物質干擾增強，減少乙腈比例，目標物質出峰受內源性物質干擾減少，但峰型較差，調節流動相pH至3.2，目標峰拖尾現象明顯減少，色譜峰型有所改善。

本試驗采用外標法，由藥物峰面積帶入外標峰面積的標準曲線求得萬古霉素的血漿濃度。目前國內相關文獻多用內標法［6-8］，如去甲萬古霉素、維生素B、替硝唑等，由于這些內標多為臨床常用藥，如果待測患者同時服用萬古霉素和內標物質，內標物質可能作為內源性雜質干擾檢測結果，因此不能準確計算萬古霉素的血藥濃度。雖然外標法簡便，但對儀器的重現性和操作條件的穩定性要求較高，需定期進行曲線校正。

萬古霉素為水溶性物質，其血漿樣品提取方法多采用蛋白沉淀法，文獻報道的沉淀劑有10%三氯醋酸溶液、30%硫酸鋅溶液、乙腈-異丙醇等，本試驗曾根據以上文獻方法對血漿樣品進行處理，結果發現外標曲線線性均不太理想，分析原因可能為操作較繁瑣，沉淀劑用量較大。選擇10%高氯酸沉淀蛋白，加入量少，色譜中雜質峰與目標峰分離較好，線性曲線較為理想。另外，此法樣品處理簡單，只需沉淀離心，可定量測定到1.7 μg/mL，此定量下限足以滿足受試者靜脈滴注500 mg萬古霉素的藥動學研究需要。

國外指南《萬古霉素治療成人金黃色葡萄球菌感染的治療監測實踐指南》認為，金黃色葡萄球菌暴露于萬古霉素谷濃度＜10 μg/mL時，可產生具有萬古霉素中介金葡菌樣特點，因此，推薦其血藥濃度谷值應保持＞10 μg/mL以避免發生耐藥;為改善臨床感染治療的預后，提高藥物的組織滲透能力，指南推薦萬古霉素血藥濃度谷值應維持在 15 ～20 μg/mL，本方法快速、簡便、準確、靈敏，為臨床開展萬古霉素血藥濃度監測提供了參考方法。

［1］陳新謙，金有豫，湯光.新編藥物學［M］.第17版.北京:人民衛生出版社，2011:85-86.

［2］Michael J，Rybak BM，Lomaestro JC，et al.Vancomycin therapeutic guidelines:a summary of consensus recommendations from the infectious diseases society of America，the American Society of Health-System Pharmacists，and the Society of Infectious Diseases Pharmacists［J］.Clin Infect Dis，2009，49(3):325-327.

［3］王佳慶，梅升輝.RP-HPLC法同時測定人體血清及腦脊液中萬古霉素的含量［J］.藥品評價，2012，9(23):22-25.

［4］范捷，郭志磊，于洋，等.高效液相色譜法測定萬古霉素血藥濃度［J］.中國醫院藥學雜志，2012，32(19):1590-1591.

［5］Baranowska I，Wilczk A，Baranowski J.Rapid UHPLC method for simultaneous determination of vancomycin，terbinafine，spironolactone，furosemide and their metabolites:application to human plasma and urine［J］.Anal Sci，2010，26(7):755-759.

［6］陳方亮，余翠琴，劉海燕，等.HPLC法測定人血清中萬古霉素和去甲萬古霉素濃度［J］.海峽藥學，2012，24(6):260-263.

［7］熊磊，蘇丹，辛華雯，等.HPLC法同時測定人血清中萬古霉素和去甲萬古霉素濃度［J］.中國藥師，2008，11(3):278-280.

［8］袁孔現，黃義澤，毛名揚，等.RP-HPLC法測定萬古霉素血藥濃度［J］.安徽醫藥，2010，14(2):163-165.