粒細胞集落刺激因子對腦出血大鼠腦水腫及星型膠質細胞可塑性的影響

何曉英，付 華，袁 平，譚 華，李小剛

腦出血(intracerebral haemorrhage，ICH)具有發展快、恢復慢、致殘重的特點，隨著老齡化進程加快發病率逐漸上升，嚴重威脅人類健康。實驗證實粒細胞集落刺激因子(granulocyte colony－stimulating factor，G－CSF)作為生物大分子可穿過大鼠血－腦脊液屏障，在中樞神經系統發揮重要的非造血功能。Laske 等［1］報道早期阿爾茨海默病 (AD)患者血漿G－CSF水平降低，外源性G －CSF 有望作為AD 新的治療策略;實驗變態反應性腦炎模型(EAE)證實G －CSF 在腦內具有抗炎功能［2］;Sevimli 等［3］研究證實G－CSF 可明顯減小腦梗死動物梗死灶、促進神經功能恢復。那么，G －CSF 對ICH 是否同樣具有神經保護作用呢?本研究通過構建ICH 模型，從腦水腫及星形膠質細胞(Astrocyte，Ast)可塑性的角度，探討G－CSF對ICH 大鼠發揮的作用及可能機制?，F報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物及分組 健康成年Sprague － Dawley 大鼠96 只，體質量(250 ～320)g，SPF 級，由瀘州醫學院動物實驗中心提供。實驗大鼠隨機分為假手術組(n =24)、ICH 組和干預組(n=36)，各組又分6h、24h、48h、72h、7d、10d 6 個亞組(假手術組n=4，ICH 組、干預組n=6)。

1.1.2 主要試劑及儀器 重組人粒細胞集落刺激因子注射液(rhG－CSF，深圳新鵬生物工程有限公司);膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)抗體(NeuMarker 公司);人基質金屬蛋白酶9(MMP－9)抗體(Santa Cruz 公司);SABC 試劑盒、DAB 顯色試劑盒以及二抗(武漢博士德公司)。大鼠腦立體定位注射儀(WDT－V，西安西北光電廠)。

1.2 方法

1.2.1 ICH 模型的制作［4］SD 大鼠術前禁食12h，2%戊巴比妥鈉(50mg/kg)腹腔注射后，俯臥位固定在立體定位儀上，無菌操作暴露前囟，用小型牙科鉆鉆透顱骨至硬腦膜處，定位于前囟前0.2 mm、中線右側旁開3mm、深6mm 為注血點，將非肝素抗凝斷尾獲取的動脈血50μl，先注入10μl，停針2min，后緩慢注入40μl，整個注血時間約5min，注血完畢后留針10～15min，再緩慢退針。術后青霉素粉末涂抹局部，縫合皮膚。所用手術器械經高壓滅菌消毒，整個手術過程無菌操作。假手術組:參照上述方法，經注入點注入等量無菌0.9%氯化鈉溶液。干預組制模成功1h 后經腹腔注射rhG －CSF (60μg/kg)，假手術組、ICH 組經腹腔注射等量0.9%氯化鈉溶液。

1.2.2 模型制作成功判斷 SD 大鼠麻醉清醒后用Garcia 測評18 分制法［5］進行神經癥狀學評分，評分為3 ～12 分的大鼠為制模成功進入實驗，死亡及評分＞12 分大鼠剔除出實驗。

1.2.3 腦組織含水量測定 采用干濕測重法:各組大鼠于相應時間點(假手術組n=2，ICH 組、干預組n =3)麻醉后迅速斷頭，剝離顱骨及硬腦膜，取出完整腦組織，去除腦膜、低位腦干和小腦，在電子精密天平上稱重 (濕重)，然后在100℃烤箱內烘烤24h，電子天平再次稱重直到最后兩次的質量差≤0.2mg 為止(干重)。按公式:BWC = (濕重－干重)÷濕重×100%計算腦組織含水量。

1.2.4 免疫組化檢測MMP－9、GFAP 各組大鼠于相應時間點(假手術組n=2，ICH 組、干預組n =3)麻醉后，經主動脈灌注4%多聚甲醛，取出腦組織，多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片。按照免疫組織化學試劑盒說明進行染色。采集系統對MMP－9、GFAP 的表達測定采用陽性細胞計數法，每只大鼠選1 張腦切片，在400 倍光鏡下隨機選取血腫周圍的4 個視野，計數每個視野的陽性細胞數，取平均值。MMP－9 陽性表達為細胞胞膜及胞漿呈棕褐色，GFAP 陽性表達為細胞胞漿及星狀突起纖維呈黃色或黃棕色。

1.3 統計學方法 采用SPSS13.0 統計軟件進行數據處理，計量資料以(± s)表示，多組間比較采用單因素方差分析(One－Way ANOVA)的最小顯著差法(LSD)，兩樣本均數比較采用t 檢驗，腦組織含水量、MMP －9 進行直線相關分析，以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組ICH 大鼠腦組織含水量比較 3 組各時間點腦組織含水量比較，差異有統計學意義(P ＜0.05);ICH 組腦組織含水量各時間點與假手術組及干預組比較，差異均有統計學意義(P ＜0.05，見表1)。

2.2 各組ICH 大鼠血腫周圍組織中MMP －9 表達比較 3 組各時間點MMP－9 表達比較，差異有統計學意義(P ＜0.05);ICH 組各時點MMP－9 表達與假手術組及干預組比較，差異均有統計學意義(P ＜0.05，見表2 及圖1、2、3)。

表1 各組不同時間點腦組織含水量比較(±s，%)Table 1 Comparison of the water content of brain tissue in each group at different time points

表1 各組不同時間點腦組織含水量比較(±s，%)Table 1 Comparison of the water content of brain tissue in each group at different time points

注:與假手術組比較，* P ＜0.05;與ICH 組比較，△P ＜0.05

組別 只數6h 24h 48h 72h 7d 10d假手術組 24 77.80±0.48 77.54±0.62 77.28±0.53 77.55±0.26 78.02±0.57 77.73±0.34 ICH 組 36 80.10±0.18* 82.47±0.10* 84.15±0.58* 84.10±0.51* 80.39±0.39* 79.43±0.26*干預組 36 78.03±0.11△79.02±0.91△80.87±0.25△79.73±0.27△78.12±0.38△77.74±0.28△

表2 各組不同時間點血腫周圍MMP－9 表達比較(±s)Table 2 Comparison of expression of MMP －9 around hematoma in each group at different time points

表2 各組不同時間點血腫周圍MMP－9 表達比較(±s)Table 2 Comparison of expression of MMP －9 around hematoma in each group at different time points

注:與假手術組比較，* P ＜0.05;與ICH 組比較，△P ＜0.05

組別 只數6h 24h 48h 72h 7d 10d假手術組 24 1.35±0.88 1.45±0.83 1.65±0.82 1.60±0.74 1.55±0.81 1.40±0.75 ICH 組 36 6.35±0.87* 8.20±0.85* 10.35±0.60* 10.55±0.82* 3.70±0.38* 3.06±1.08*干預組 36 3.32±0.20△ 5.54±0.11△ 6.83±0.25△ 6.80±0.45△2.85±0.01△1.98±0.23△

圖1 假手術組MMP－9 少量表達(×400)Figure 1 Few expression of MMP－9 in sham operation group

圖2 ICH 組72h MMP－9 大量表達(×400)Figure 2 Abundant expression of MMP－9 in ICH group in 72h

圖3 干預組72h MMP－9 表達量較ICH 組減少(×400)Figure 3 72h MMP－9 intervention group decreased compared with that in ICH group

2.3 腦組織含水量與MMP－9 相關性分析 假手術組腦組織含水量與MMP－9 表達無線性相關(r =0.429，P =0.3961);ICH 組腦組織含水量與MMP －9 表達呈正相關(r =0.922，P=0.0089);干預組腦組織含水量與MMP－9 表達呈正相關(r=0.844，P=0.0345)。

2.4 各組ICH 大鼠血腫周圍組織中GFAP 測定 假手術組未見GFAP 陽性細胞表達。ICH 組6h 即有少量GFAP 陽性細胞表達，分布稀疏、著色較淺、胞體體積較小、突起分支較少;48h 開始增多，72h 出現大量表達，7d GFAP 達高峰，胞體肥大、突起增粗且增長、著色較深;10d GFAP 陽性細胞表達減少。干預組6h GFAP 陽性細胞表達與ICH 組比較，差異無統計學意義(P ＞0.05);24h、48h、72h、7d、10d 與ICH 組比較，差異有統計學意義(P ＜0.05)，細胞變形程度減輕(見表3 及圖4、5、6)。

表3 各組不同時間點血腫周圍GFAP 陽性細胞表達比較(±s)Table 3 Comparison of expression of GFAP positive cells around hematoma in each group at different time points

表3 各組不同時間點血腫周圍GFAP 陽性細胞表達比較(±s)Table 3 Comparison of expression of GFAP positive cells around hematoma in each group at different time points

注:－為無GFAP 陽性蛋白表達;與ICH 組比較，▲P ＜0.05

6h 24h 48h 72h 7d 10d假手術組組別 只數24－－－－－－ICH 組 36 18.58±1.42 28.27±1.30 39.24±6.70 51.57±6.97 70.61±6.85 53.47±6.02干預組 36 19.02±1.53 20.02±2.30▲32.46±4.49▲36.33±5.35▲45.25±6.17▲39.19±5.64▲

圖4 假手術組無GFAP 表達(×400)Figure 4 No expression of GFAP in sham operation group

圖5 ICH 組7d GFAP 大量表達(×400)Figure 5 Abundant expression of GFAP in ICH group in 72h

圖6 干預組7dGFAP 表達量較ICH 組減少(×400)Figure 6 72h GFAP intervention group decreased compared with that in ICH group

3 討論

G－CSF 是一種20kDa 的蛋白質，屬造血生長因子家族的一員，在臨床已廣泛用于腫瘤患者化療后或血液系統疾病如粒細胞減少癥等的治療。近年來越來越多的實驗證據表明G－CSF存在中樞神經系統并發揮著重要的非造血功能。初期學者們推測G －CSF 在中樞神經系統發揮生物學作用可能是G－CSF動員了自體骨髓干細胞(BMSC)，然后透過血－腦脊液屏障進入顱內，橫向分化成神經干細胞，從而促進神經元再生以及神經功能恢復［6］。隨著研究的深入，Sch?bitz 等［7］在離體實驗中發現在受到刺激的星形膠質細胞上有G －CSF 表達，Schneider 等［8］采用雙重免疫標記法標記NeuN 與G －CSF，發現體內正常腦組織神經元上也有G － CSF 表達。另一方面，Schneider 等［8］應用免疫組化、western Blot 和RT－PCR 法均證實鼠腦的神經元和膠質細胞有G－CSF 受體(G－CSF－R)存在。在此基礎上，Hasselblatt 等［9］試驗證實G －CSF 在中樞神經系統通過與效應細胞表面特異性G －CSF －R 結合發揮生物學作用。腦組織存在內源性G －CSF 并在特定的條件下能與G－CS－R結合參與中樞神經系統復雜的病理生理過程，那么，外源性G－CSF 能否透過血－腦脊液屏障進入中樞神經系統呢?Solaroglu 等［10］采用不能透過血－腦脊液屏障的碘化牛血清蛋白作為對照，給大鼠注射碘化的G － CSF，計算注射后1h、4h、24h 碘化G－CSF 和碘化清蛋白的腦/血清比值，實驗發現G－CSF 顯示一個較高的腦/血清比值，證實G －CSF 能夠通過完整的血－腦脊液屏障，為外源性G －CSF 治療中樞系統疾病提供了科學的基礎理論依據。

G－CSF 對缺血性腦血管病神經保護作用的研究較多，動物及部分臨床實驗均證實腦梗死后G－CSF 可以減少神經元凋亡、促進血管新生、減輕炎癥反應、減少梗死面積等［11－12］。而G－CSF 對ICH 的神經保護作用及機制的研究鮮見報道。腦水腫是ICH 最為嚴重的繼發性損傷，本實驗建立大鼠自體血ICH 模型，研究顯示ICH 組腦組織含水量各時間點明顯高于假手術組，48 ～72h 達高峰，至第7d 后逐漸恢復;而干預組腦組織含水量各時間點明顯低于ICH 組，說明G －CSF 減輕了ICH 后的腦水腫。實驗進一步研究了G －CSF 減輕腦水腫程度的可能機制，MMP －9 是影響腦水腫發生發展的重要因素之一。Gursoy－Ozdemir 等［13］對基因遺傳工程小鼠的實驗研究證實MMP－9 能夠改變血－ 腦脊液屏障通透性并加重腦水腫。應用核磁共振技術對臨床患者觀察發現，ICH 患者腦水腫消漲規律與血清MMP－9 變化一致［14］。本實驗也發現ICH 組各時點MMP－9 表達明顯高于假手術組，48 ～72h 達高峰，對ICH組中MMP－9 表達和腦組織含水量進行相關性分析，發現兩者呈正相關，說明ICH 后MMP －9 表達增強并參與了ICH 后腦水腫形成。干預組各時點MMP －9 表達明顯輕于ICH 組，提示G－CSF 抑制了MMP－9 的表達，相關性分析發現干預組MMP－9 表達和腦組織含水量也呈正相關。因此，G －CSF 可能通過下調MMP －9 的表達減輕了ICH 后腦水腫，其確切機制尚需進一步研究。

Ast 是腦內數量最多的神經膠質細胞類型，正常條件下，它對神經元起到營養、支持、保護作用，并積極參與神經元再生修復的電生理活動。受到某些外傷、應激、腦損傷后Ast 具有改變自身特性適應損傷刺激的能力，即可塑性，稱之為Ast活化，其表型上包括:細胞數量上的增加，細胞胞體、胞核大小及突起長度的變化［15］。GFAP 是Ast 獨有的骨架蛋白，在有活性的Ast 中豐富表達，GFAP 在正常Ast 分布較少，其主要存在于活化Ast 中，其表達與Ast 的活性呈正比，可反映Ast的活化程度［16］?；罨腁st 在腦損害后有利弊雙向作用，一方面，調節細胞鉀、鈣內外離子的濃度可增強能量代謝能力;釋放神經營養因子 (GDNF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、腦源性神經營養因子(BDNF)等營養成分和細胞因子;合成大量的載脂蛋白E 重建神經元完整性，修復神經功能，發揮神經保護作用［17］。另一方面，活化的Ast 可產生大量一氧化氮(NO)，通過對大分子特別是DNA 的修飾，可導致細胞凋亡和壞死;可以產生多種細胞因子和炎性遞質介導炎性反應，促進內皮細胞壞死，引起血－腦脊液屏障開放，參與腦水腫病理過程;過度的膠質化也可以作為機械屏障妨礙髓鞘和軸索的再生，影響周圍神經組織結構和功能恢復［18］。因此，活化的Ast 對ICH 后神經組織是一把雙刃劍，依靠神經系統代償性的自我調節不足以既發揮Ast 的神經保護作用，同時又抑制Ast 神經毒性作用，可能是導致ICH 預后不佳的因素之一。因此，Ast 在ICH 中適度活化無疑具有重要意義。

Komine－Kobayashi 等［19］研究發現G －CSF 干預腦梗死后活化的Ast 減少，其表達的一氧化氮合酶(iNOS)被抑制，腦損害程度減輕。本實驗也觀察到假手術組無GFAP 陽性細胞表達，表明Ast 處于相對穩定狀態;ICH 組6h 開始GFAP 少許表達，隨時間延長逐漸增多，72h 大量表達，7d 達高峰，該規律與已有研究報道基本一致［20］;干預組6h GFAP 表達與ICH組相似，24h、48h、72h、7d、10d 時GFAP 表達較ICH 明顯減少，細胞變形程度減輕，實驗結果提示G －CSF 下調了ICH后GFAP 表達，抑制Ast 過度活化。理論上G － CSF 抑制了ICH 大鼠Ast 過度膠質化，可增強對神經元的保護作用，而減輕對腦組織的損傷作用，但是怎樣才能使GFAP 恰好維持在一個適當的水平從而最大限度發揮Ast 的神經保護作用以及G－CSF抑制Ast 過度活化的確切機制有待深入研究。

1 Laske C，Stellos K，Stransky E，et al. Decreased plasma levels of granulocyte－colony stimulating factor (G－CSF)in patients with early Alzheimer's disease ［J］. J Alzheimers Dis，2009，17 (1):115 －123.

2 Zavala F，Abad S，Ezine S，et al. G－CSF therapy of ongoing experimental allergic encephalomyelitis via chemokine and cytokine－based immune deviation ［J］. J Immunol，2002，168 (4):2011 －2019.

3 Sevimli S，Diederich K，Strecker JK，et al. Endogenous brain protection by granuloeyte－colony stimulating factor after ischemic stroke ［J］.Exp Neurol，2009，217 (2):328 －335.

4 Deinsberger W，Vogel J，Kuschinsky W，et al. Experimental intracerebral hemorrhage:decription of a double injection model in rats ［J］.Neurol Res，1996，18 (5):475 －477.

5 Gareia JH，Whgner S，Liu KF，et al. Neurological deficit and extent of neuronal neurosis attributable to middle cerebral artery occlusion in rats:statistical validation ［J］. Stroke，1995，26:627 －635.

6 Corti S，Locatelli F，Strazzer S，et al. Modulated generation of neuronal cells from bone marrow by expansion and mobilization of circulating stem cells with in vivo cytokine treatment ［J］. Exp Neurol，2002，177 (2):443 －452.

7 Sch?bitz WR，Kollmar R，Schwaninger M，et al. Neuroprotective effect of granulocyte colony－stimulating factor after focal cerebral ischemia ［J］. Stroke，2003，34 (3):745 －751.

8 Schneider A，Krüger C，Steigleder T，et al. The hematopoietic factor G－CSF is a neuronal ligand that counteracts programmed cell death and drives neurogenesis ［J］. J Clin Invest，2005，115 (8):2083 －2098.

9 Hasselblatt M，Jeibmann A，Riesmeier B，et al. Granuloeyte colony stimulating factor (G － CSF)and G － CSF receptor expression in human ischemie stroke ［J］. Acta Neuropathol，2007，113 (l):45 －51.

10 Solaroglu I，Cahill J，Tsubokawa T，et al. Granulocyte colony －stimulating factor protects the brain against experimental stroke via inhibition of apoptosis and inflammation ［J］. Neurol Res，2009，31(2):167 －172.

11 Sugiyama Y，Yagita Y，Oyama N，et al. Granulocyte colony－stimulating factor enhances arteriogenesis and ameliorates cerebral damage in a mouse model of ischemic stroke ［J］. Stroke，2011，42 (3):770－775.

12 England TJ，Abaei M，Auer DP，et al. Granulocyte colony －stimulating factor for mobilizing bone marrow stem cells in subacute stroke:the stem cell trial of recovery enhancement after stroke 2 randomized controlled trial ［J］. Stroke，2012，43 (2):405 －411.

13 Gursoy － Ozdemir Y，Qiu J，Matsuoka N，et al. Cortical spreading depression activates and upregulates MMP － 9 ［J］. J Clin Invest，2004，113 (10):1447 －1455.

14 Barr TL，Latour LL，Lee KY，et al. Blood －brain barrier disruption in humans is independently associated with increased matrix metalloproteinase－9 ［J］. Stroke，2010，41 (3):e123 －128.

15 Barker AJ，Ullian EM. Astrocytes and synaptic plasticity ［J］. Neuroscientist，2010，16 (1):40 －50.

16 Love S，McLean C. Overview and recent advances in neuropathology［J］. Pathology，2011，43 (2):87.

17 Brouns R，De Vil B，Cras P，et al. Neurobiochemical markers of brain damage in cerebrospinal fluid of acute ischemic stroke patients［J］. Clin Chem，2010，56 (3):451 －458.

18 梁彥濤，張敬軍. 膠原纖維酸性蛋白基礎與臨床研究進展［J］.醫學綜述，2009，15 (16):2407 －2409.

19 Komine － Kobayashi M，Zhang N，Liu M，et al. Neuroprotective effect of recombinant human granulocyte colony － stimulating factor in transient focal ischemia of mice ［J］. J Cereb Blood Flow Metab，2006，26 (3):402 －413.

20 Masuda T，Maki M，Hara K，et al. Peri－hemorrhagic degeneration accompanies stereotaxic collagenase － mediated cortical hemorrhage in mouse ［J］. Brain Res，2010，1355:228 －239.