人臍帶間充質干細胞在膠原支架材料體外復合培養的生物學特性研究

王 琦， 劉宏利， 張中東， 虞攀峰， 初 冬

(中國人民解放軍空軍總醫院急診部， 北京 100036)

許多研究及本課題前期實驗中已證實，臍帶來源間充質干細胞體外誘導條件下可以分別向骨、軟骨、脂肪組織分化，是組織工程良好的種子細胞。本研究在前期的實驗中發現膠原蛋白支架與MSCs具有很好的生物相容性，MSCs可以在膠原蛋白支架中逐漸貼附，隨著培養時間的延長，細胞長入孔隙內[1]，進一步用免疫組織化學的方法觀察人臍帶間充質干細胞在膠原蛋白支架培養兩周后細胞特性變化，為作為組織工程復合體材料制備打下實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料:人臍帶間充質干細胞分離自健康足月產婦臍帶，Ⅱ型膠原蛋白購買自北京貝菱公司，是將18個月齡的健康牛跟腱通過酶解獲得，DMEM培養基采用市售產品，免疫組化ABC試劑盒購買自DAKO A/S Denmark，CD 44、CD105、HLA-DR、Ⅰ型膠原抗體購于中山公司。

1.2 方法

1.2.1 人臍帶間充質干細胞(human umbilical MSCs，hU-MSCs)的培養細胞表面標志鑒定及體外分化實驗:將臍帶血管內血液擠凈，再將包裹著血管的Wharton膠剪下、剪碎。將組織小塊收集于50mL離心管內，反復清洗2-3次，清洗后的組織小塊種植于100 mm培養皿，加入含10%FBS的a-MEM培養基，在37℃、飽和濕度5%濃度的CO2培養箱內培養，隔2日更換培養基，細胞達到80%匯合時更換新鮮培養液，次日胰酶消化傳代，計數后接種于新的培養瓶。取第4代生長狀態良好細胞，制備成單細胞懸液，上流式細胞儀檢測。體外分化實驗進行MSCs體外成骨和成脂肪能力鑒定。

1.2.2 支架與細胞共培養:將膠原蛋白支架材料置入24孔培養板中，每孔各一塊，取消化后體外培養的第6代細胞制成單細胞懸液，細胞密度2×106mL-1，每孔接種2mL，并浸沒支架，第二日更換培養液，每日使用相差顯微鏡觀察細胞與生物材料附著及生長等情況。

1.2.3 組織學觀察:植入2周后，取出標本，以10%中性福爾馬林固定，制備石臘切片，HE染色。

1.2.4 免疫組織化學:切片脫蠟入水，緩沖液沖洗2次，0.3%-3%H2O2抗原修復，室溫，緩沖液3次;羊血清封閉30min，緩沖液3次，加入I抗4℃，濕盒過夜;室溫復溫1h，緩沖液3次，加入 II抗工作液，37℃、45min、濕盒;緩沖液3次，加入 III抗工作液，37℃，45min，濕盒;緩沖液3 次，;0.05M Tris-HCl(PH7.4)5min，室溫;DAB顯色，沖冼后置入蒸餾水，梯度酒精脫水，二甲苯透明，甘油明膠封片;對照組緩沖液代替一抗。

2 結果

2.1 hUC-MSCs細胞培養及鑒定:接種后7-12d可見細胞從組織塊爬出，呈成纖維細胞樣，約2周時細胞達到80%匯合，可進行傳代，生長旺盛，流式分析表明，培養的 MSCs樣細胞表達 CD29、CD44、CD73、CD105、CD166、HLA-A，B，C，(MHC-Ⅰ);不表達 CD31(內皮細胞抗原)、CD34(造血干細胞抗原)、CD45(白細胞共同抗原)、和HLA-DR(MHC-II)。細胞經成骨和成脂誘導后高表達堿性磷酸酶活性及細胞內出現脂滴，證明細胞具備成骨和成脂肪能力。

2.2 相差顯微鏡鏡下及組織化學結果:臍帶間充質干細胞與支架共培養24h，細胞對支架材料有良好的趨向性，在倒置顯微鏡下在支架材料的邊緣明顯可見細胞長入，大部分細胞呈梭形、多角形、不規則形等，黏附于膠原蛋白細胞支架上，HE染色顯示細胞生長形態呈棱形和多角形。膠原蛋白的多孔結構非常有利于細胞長入，在膠原蛋白纖維上有細胞密集區，細胞核呈橢圓形，染淡藍色，胞質染淡紅色，具有良好的生長形態，在細胞與纖維之間以及細胞與細胞之間均有較多突起相互交連，結果見圖1、圖2。

圖2 HE染色顯示細胞生長形態呈棱形和多角形

2.3 免疫組織化學觀察:免疫組織化學染色在光鏡下觀察陽性信號為藍紫色，在光鏡下可清晰看到支架中的細胞呈樹突狀結構，細胞胞漿成藍紫色，CD44、CD105、Ⅰ型膠原均表達陽性。HLA-DR組未見胞漿呈藍紫色信號，HLA-DR表達陰性。陰性對照組織均未見到陽性信號。結果見圖3-5。

圖3 CD44表達陽性

圖4 CD105型抗體表達陽性

圖5 Ⅰ型膠原免疫組織化學染色陽性

3 討論

組織工程的重要作用是用于修復組織缺損，而單純細胞移植，由于缺乏附著點和空間結構支持而呈漂浮狀態，也無良好的移植微環境，不利于細胞存活和發揮正常功能。因此在損傷部位橋接組織工程支架材料受到了廣泛關注，理想的載體材料應該具有良好的組織相容性、生物降解性、生物活性等[2，3]。可作為移植治療的載體及移植后的生長支架，對骨缺損起支撐填充作用，待細胞分化增殖填充后又可自行降解。常用細胞及生物材料復合移植有體內直接植入法和體外復合細胞培養后再植入兩種[4]，體內直接植入由于受多種體內環境因素的影響，不能準確觀察到生物材料與組織細胞的相容情況，而體外復合細胞培養可以直接觀察細胞與生物材料復合生長的情況，較前者更為敏感、客觀[5，6]，是近年來研究生物材料相容性的主要方法。

臍帶來源間充質干細胞細胞免疫表型與骨髓源性的MCS相似，體外誘導條件下可以分別向骨、軟骨、脂肪組織分化，在體內具有成骨能力，可以為骨組織工程提供新的種子細胞來源。本實驗選用膠原蛋白支架與MSCs在體外復合培養，觀察臍帶來源間充質干細胞在生物材料支架培養的免疫表型和成骨特性變化，膠原是動物體內含量最豐富的蛋白，膠原不僅為細胞提供支持保護作用，而且與細胞的粘附、生長、表型表達均有密切關系，可見膠原蛋白支架與MSCs具有很好的生物相容性。

進一步免疫組織化學染色，在光鏡下可清晰看到支架中的細胞呈樹突狀結構，細胞胞漿成藍紫色陽性信號，CD44、CD105、Ⅰ型膠原表達陽性，盡管不同學者檢測MSCs表面標志物結果不盡相同，但一般認為MSCs樣細胞表達 CD29，CD44，CD73，CD105，CD166，HLA-A，B，C，(MHC-Ⅰ);不表達 CD31(內皮細胞抗原)，CD34(造血干細胞抗原)，CD45(白細胞共同抗原)，和HLA-DR(MHC-II)，但在支架上培養的hUCMSCs表達 CD44、CD105、不表達 HLA-DR，表明混合培養中不僅細胞與支架相容性良好，提示細胞在支架上培養仍保持了其干細胞的免疫表型。

[1]王琦，刁垠澤，馬慶軍.人臍帶間充質干細胞的分離培養及其與膠原支架的相容性[J].組織工程與重建外科雜志，2009，5:1-3.

[2]Bruno S，Grange C，Deregibus MC，et al.Mesenchymal stemcell-derived microvesicles protect against acute tubular injury[J].Am Soc Nephrol，2009，20(5):1053-1067.

[3]Tetta C，BrunoS，Fonsato V，et al.The role of microvesicles in tissue repair[J].Organogenesis，2011，7(2):105-115.

[4]Fansa H，Keilhoff G.Comparison of different biogenic matrices seeded with cultured Schwann cells for bridging peripheral nerve defects[J].Neurol Res，2004，26(2):167-173.

[5]王恒湘，郭子寬.間充質干細胞在組織再生應用中的諸多問題[J].組織工程與重建外科雜志，2008，4:

[6]Neumann A，Reske T，Held M，et al.Comparative investigation of the biocompatibility of various silicon nitride ceramic qualities in vitro[J].Mater Sci Mater Med，2004，15(10):1135-1140.