PTEN survivin基因在肝癌組織中的蛋白表達(dá)及相關(guān)研究

王立成， 于淑玲， 于淑莉

(1.河北省承德市中心醫(yī)院普外科， 河北 承德 067000

2.河北省承德市第三醫(yī)院，河北 承德 067000

3.河北省承德市婦幼保健院， 河北 承德 067000)

本研究應(yīng)用免疫組化的方法探討凋亡相關(guān)的兩個(gè)基因PTEN和survivin在HCC的表達(dá)情況與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系及其相關(guān)性，以期探討評(píng)估HCC肝切除術(shù)后預(yù)后的相關(guān)指標(biāo)，為肝癌的發(fā)生發(fā)展及治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本:肝癌標(biāo)本43例均為承德市中心醫(yī)院2004年6月至2010年1月間手術(shù)切除標(biāo)本，術(shù)前均未放化療，術(shù)后病理診斷為肝癌，切除肝癌標(biāo)本常規(guī)制成蠟塊保存。癌旁組織取自癌灶旁2-3cm，經(jīng)病理證實(shí)無(wú)癌細(xì)胞。臨床病理資料完整。男33例，女10例，年齡30-71歲，平均51±9.29歲;小肝癌(直徑≤5cm)16例，大肝癌(直徑＞5cm)27例;TNM臨床分期:Ⅰ期5例，Ⅱ期20例，Ⅲ期10例，Ⅳ期8例:組織學(xué)分級(jí)(Edmondson分級(jí)):Ⅰ級(jí)4例，Ⅱ級(jí)16例，Ⅲ級(jí)18例，Ⅳ級(jí)5例;術(shù)前血清AFP＞400g/L19例、侵襲轉(zhuǎn)移傾向高危組15例(15/43)，侵襲轉(zhuǎn)移傾向低危組28例(28/43)。血清AFP＞400μg/L 19例，＜400μg/L 24例。符合下列條件之一為侵襲轉(zhuǎn)移傾向高危組:肝門(mén)淋巴結(jié)癌轉(zhuǎn)移;門(mén)靜脈有癌栓;同一肝葉內(nèi)主癌灶周?chē)[瘤數(shù)目＞2個(gè)或有多個(gè)小衛(wèi)星結(jié)節(jié)或伴有包膜侵襲破壞，無(wú)上述特征者為侵襲轉(zhuǎn)移傾向低危組。

1.2 試劑:小鼠抗人PTEN單克隆抗體、S-P法免疫組化檢測(cè)試劑 、DAB染色試劑盒(均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，鼠抗人survivin單克隆抗體(福州邁新生物技術(shù)有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法:蠟塊均做4μm厚連續(xù)切片。免疫組化采用鏈霉菌-生物素(S-P)法，DAB顯色、蘇木素復(fù)染、脫水、二甲苯透明、中性樹(shù)膠封固。以0.01MPBS液(pH=7.5)替代一抗作為每次染色的陰性對(duì)照，已知表達(dá)的肝癌組織作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.3.1 PTEN結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn):PTEN蛋白陽(yáng)性信號(hào)主要位于細(xì)胞胞漿內(nèi)。PTEN蛋白在組織中的染色情況分3種:所有細(xì)胞均著棕色;部分細(xì)胞著棕色，部分細(xì)胞未著色(混合型染色);所有細(xì)胞均未著色。其中A，B歸為PTEN陽(yáng)性表達(dá)組，C為PTEN陰性組。

1.3.2 survivin結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn):survivin蛋白表達(dá)主要位于胞漿或胞膜，按切片中腫瘤顯色深淺計(jì)分:A.細(xì)胞漿無(wú)顯色，0分(-)，B.細(xì)胞漿呈淡黃色石霧狀，1分(1+)，C.細(xì)胞漿呈黃色顆粒狀，2分(2+)，D.細(xì)胞漿呈均勻深黃色，3分(3+)。A、B為陰性，C、D為陽(yáng)性表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:應(yīng)用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。定性資料應(yīng)用X2、spearman等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)分析，P＜0.05存在顯著差異，P＜0.01有極顯著意義。

2 結(jié)果

2.1 PTEN蛋白的表達(dá):43例HCC組織中PTEN蛋白表達(dá)陽(yáng)性率48.8%(21/43)，陽(yáng)性表達(dá)均位于HCC細(xì)胞漿(圖1-A)。癌旁組織中PTEN蛋白表達(dá)陽(yáng)性率100%，癌組織與癌旁的表達(dá)差異顯著(P＜0.01)。PTEN蛋白的表達(dá)與HCC的組織分化程度(Edmondson病理分級(jí))相關(guān)(r=0.477，P=0.026)，與血清AFP的濃度相關(guān)(r=-0.460，P=0.032)，與TNM分期、腫瘤侵襲性無(wú)關(guān)，見(jiàn)表1)。

表1 PTEN表達(dá)與HCC臨床病理特征的關(guān)系

2.2 survivin的表達(dá):43例HCC中有30例陽(yáng)性表達(dá)，表達(dá)率69.77%，(30/43)(圖1-G)大多數(shù)表達(dá)產(chǎn)物位于胞漿中(只有2例胞核弱表達(dá))，癌旁肝組織中陽(yáng)性率為25.58%(11/43)，癌組織的陽(yáng)性率顯著高于癌旁肝組織，有顯著性差異(P＜0.01)，與血清AFP、腫瘤侵襲性和腫瘤細(xì)胞分化程度(Edmondson分級(jí))有關(guān)(r=0.404，P=0.038;r=0.475，p=0.030;r=-0.490，P=0.021)，與TNM分期無(wú)相關(guān)，見(jiàn)表2。

表2 survivin的表達(dá)與HCC臨床病理特征的關(guān)系

2.3 PTEN與survivin之間的關(guān)系:分析本組43例HCC組織標(biāo)本中PTEN，survivin基因的相關(guān)性(見(jiàn)表3)。經(jīng)spearman相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)PTEN與survivin的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.471，P=0.031)，見(jiàn)表3。200)，B HCC 組織 Pten陰性表達(dá)(×200)，C PTEN 癌旁組織陽(yáng)性(×100)，D HCC組織survivin陽(yáng)性表達(dá)(×100)，E HCC 組織 survivin陰性表達(dá)(×200)，F(xiàn) HCC組織Survivin陽(yáng)性表達(dá)(×40倍)。

表3 PTEN與survivin表達(dá)的關(guān)系

圖1 A PTEN在HCC組織中的陽(yáng)性表達(dá)(×

3 討論

PTEN基因是具有雙重特性磷酸酶活性的抑癌基因，參與細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，在腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)、血管發(fā)生及腫瘤轉(zhuǎn)移中起到一定的作用。目前己在惡性膠質(zhì)瘤、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌等腫瘤中證實(shí)了這種基因的缺失和突變，PTEN雜合性缺失率為33%[1]。本組資料PTEN蛋白的陽(yáng)性表達(dá)，癌組織為48.8%，癌旁組織為100%。資料顯示PTEN蛋白的表達(dá)與Edmondson病理分級(jí)相關(guān):Edmonson分級(jí)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級(jí)的陰性缺失率依次為20%，17.2%，54.2%和85.7%，表明HCC分化越差PTEN的缺失表達(dá)率越高，可能PTEN的缺失表達(dá)與HCC的進(jìn)展有關(guān)。PTEN基因的表達(dá)與病人外周血AFP濃度和Edmondson病理分級(jí)相關(guān)，可能參與了HCC的發(fā)生發(fā)展，對(duì)腫瘤的診斷、治療和預(yù)后的判斷和評(píng)估可提供幫助。

Survivin基因是新近發(fā)現(xiàn)的一種凋亡抑制基因，具有抑制凋亡和調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂雙重功能，一方面表達(dá)于胚胎和發(fā)育的胎兒組織，但不見(jiàn)于終末分化的成人組織;另一方面又廣泛表達(dá)于人類(lèi)各種常見(jiàn)腫瘤組織，如肝癌、肺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、乳腺癌等。本組 sur-vivin在癌組織中的表達(dá)率為69.77%，癌旁肝組織陽(yáng)性率為25.58%，癌組織的陽(yáng)性率顯著高于癌旁肝硬化組織和正常肝組織，與多數(shù)研究結(jié)果相近。Survivin的表達(dá)與腫瘤細(xì)胞分化程度即病理分級(jí)具有負(fù)相關(guān)趨勢(shì)[2]，本文結(jié)果亦顯示Survivin蛋白的表達(dá)與肝癌的病理分級(jí)有明顯相關(guān)，是肝癌分化差的標(biāo)記，并與肝癌的AFP、侵襲性相關(guān)，與肝功能分級(jí)無(wú)明顯的相關(guān)性。我們認(rèn)為survivin在HCC組織中呈高表達(dá)，促進(jìn)了肝細(xì)胞的增殖和侵襲，可能參與肝臟組織惡變過(guò)程。說(shuō)明該基因可能在肝癌的發(fā)生早期就產(chǎn)生影響，并且在癌腫的發(fā)展中起作用。

我們發(fā)現(xiàn)HCC的survivin陽(yáng)性表達(dá)率越高，PTEN的陽(yáng)性表達(dá)率越低，肝癌的分化越差，二者的陽(yáng)性表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，且均與HCC組織的病理分級(jí)、外周血中的AFP濃度相關(guān);PTEN失表達(dá)的病例中，survivin蛋白大多表達(dá)陽(yáng)性，提示組織中PTEN基因失活可能促使Survivin基因發(fā)生作用，可能機(jī)制為通過(guò)負(fù)向調(diào)節(jié)PI3K/AKt信號(hào)通路使Survivin下調(diào)，而PTEN的失活使得AKt活化，引起survivin上調(diào)，抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，共同參與腫瘤的形成機(jī)制，促進(jìn)癌的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移。可以認(rèn)為兩者參與HCC發(fā)病機(jī)制的作用方式、作用點(diǎn)相似或相近，但作用方向和生物學(xué)效應(yīng)相反[3]，有助于對(duì)HCC發(fā)病機(jī)制的進(jìn)一步研究。它們的聯(lián)合檢測(cè)可能對(duì)惡性程度的判定，預(yù)后分析和進(jìn)一步治療提供有效的依據(jù)。在子宮內(nèi)膜癌[4]、結(jié)直腸癌中得到相同結(jié)論。

[1]Xiao，Wuh，Pandolfil，et al.A strocyte inactivation of the pRB pathway predisposes mice to malignant astrocytoma development that is accelerated by PTEN mutation[J].Cancer Cell，2002，1(2):157-168.

[2]Fields AS，Cotsonis G，Sexton D，et al.Survivin expression hepatocelluar carcinoma has correlation with proliferation prognostic parameters and outcome[J].Mod Pathol，2004，11:3356-3358.

[3]陶麗麗，陳莉.Survivin和PTEN蛋白在肝癌中表達(dá)關(guān)系探討[J].南通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2006，26(1):38-40.

[4]Pallares J，Martinez JI，Dolecet X，et al.Survivin expression in endometrial carcinoma:A tissue microarray study with correlation with PTEN and STAT-3[J].Int Gynecol Pathol，2005，24(3):247-253.