硫氧還蛋白還原酶與循環(huán)系統(tǒng)疾病

袁 媛（綜述），谷 翔（審校）

（九江學院附屬醫(yī)院心內(nèi)科，江西 九江 332000）

硫氧還蛋白還原酶（thioredoxin reductase,TrxR）是一種包含黃素腺嘌呤二核苷酸 （flavin adenine dinucleotide，F(xiàn)AD）結(jié)構(gòu)域的二聚體硒蛋白，是唯一能夠催化形成還原型硫氧還蛋白的硒酶。由于其廣泛的底物特異性，能參與到各種氧化還原、炎癥、細胞凋亡等生理過程中。由TrxR、硫氧還蛋白（Trx）和還原型輔酶（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）組成了硫氧還蛋白系統(tǒng)。硫氧還蛋白系統(tǒng)是細胞內(nèi)最重要的抗氧化系統(tǒng)之一，同時具有修復蛋白質(zhì)活性、清除氧自由基和促進腫瘤生長等作用。TrxR廣泛分布于原核細胞和各類生物體細胞中，主要有3種同工酶，分別為TrxR1、TrxR2和 TrxR3。 有研究［1］證實，TrxR 在腫瘤、寄生蟲、感染性疾病、免疫缺陷性疾病、類風濕性關節(jié)炎及循環(huán)系統(tǒng)等疾病中發(fā)揮重要作用。循環(huán)系統(tǒng)疾病是威脅人類健康的主要疾病，它與炎癥反應和氧化應激有著密切的聯(lián)系。本文就TrxR的結(jié)構(gòu)、功能及其與循環(huán)系統(tǒng)疾病相關的基礎研究進展進行如下綜述。

1 TrxR

自1977年Holmgren等［2］在牛的組織中分離純化出來TrxR后，人們相繼在大腸桿菌等原核生物、昆蟲、植物、酵母菌和哺乳動物中發(fā)現(xiàn)了 TrxR［3－4］。1996 年，Tamura 等［5－6］從人類肺腺癌細胞和 T 細胞中純化得到的TrxR，同時發(fā)現(xiàn)它是含硒的蛋白質(zhì)，哺乳動物的TrxR能夠催化多種反應，大大高于低級生物中TrxR的生物活性。因此對于哺乳動物的TrxR研究較為透徹。

1.1 TrxR的分類

TrxR根據(jù)其在機體的分子質(zhì)量，可分為大分子TrxR和小分子TrxR兩大類。大分子TrxR主要分布在哺乳動物中，其分子質(zhì)量為55～65 ku。小分子TrxR主要分布在原核生物、植物、酵母和某些原生動物中，其分子質(zhì)量為35 ku。

目前TrxR的研究主要集中在哺乳動物中。有研究［7-8］發(fā)現(xiàn)，哺乳動物中TrxR主要有3種同工酶，根據(jù)其分布區(qū)域的不同，分為TrxR1、TrxR2和TrxR3。TrxR1主要分布在組織細胞漿中，也是目前研究和了解最多的一種同工酶；TrxR2主要分布在線粒體中；TrxR3主要分布在睪丸組織中，因其額外的N-末端單側(cè)的谷氧還蛋白區(qū)域，能催化還原態(tài)谷胱甘肽，故被稱為硫氧還蛋白和谷胱甘肽還原酶（thioredoxin and glutathione reductase，TGR）。

1.2 TrxR的結(jié)構(gòu)

目前研究［9］發(fā)現(xiàn)，所有哺乳動物的TrxR結(jié)構(gòu)中都包含硒半脫氨酸（Sec）。在TrxR結(jié)構(gòu)中，硒半脫氨酸位于C-末端，以-Gly-Cys-sec-Gly-序列存在于各種TrxR同功酶中。硒半脫氨酸由密碼子UGA翻譯，容易與硫氧還蛋白和其他蛋白形成氧化還原反應，是TrxR產(chǎn)生生物活性的重要結(jié)構(gòu)。TrxR2其N-末端有一堿性殘基，由33個氨基酸組成，與TrxR1有84%的序列相似度。Rigobello等［10］在大鼠肝臟中、Watabe 等［11］在牛的腎上腺皮質(zhì)中均提純出TrxR2，因此推測，TrxR在肝臟和心臟的功能形成上起著重要作用。TrxR2在細胞中以ATP的形式產(chǎn)生大量的能量，同時參與了細胞的凋亡。Nalvarte等［12］研究表明，TrxR2過量表達的HEK-293細胞比對照細胞有更強的抵抗線粒體復合物Ⅲ誘導的毒性作用。TrxR3的N-末端富含精氨酸，形成α-螺旋；另有一含硫的谷胱甘肽區(qū)域，能催化谷胱甘肽和硫氧還蛋白保持其還原態(tài)。因TrxR3主要存在于睪丸中，故其與男性生育能力有一定的關系。

1.3 TrxR的生物學活性

1.3.1 調(diào)節(jié)氧化還原反應

TrxR是一類含有硒半脫氨酸的氧化還原酶，以二聚體的形式存在，其中含有一個二硫鍵和一個FAD。它能催化Trx上的-s2還原成（-SH）2，即維持Trx的還原型。哺乳動物中的TrxR較低等生物具有更廣泛的底物特異性，除了能直接還原Trx外，也能還原其他非二硫化合物，如維生素C、亞硒酸鹽、脂質(zhì)氫過氧化物酶、VK3、氧化型谷胱甘肽等。TrxR的廣泛特異性可能與C-末端的硒半脫氨酸氧化還原活性位點有關。TrxR必須通過還原型輔酶Ⅱ（NADPH）提供電子來還原 5，5’=硫代雙（2-硝基苯甲酸）（DTNB），因此根據(jù)此反應中NADPH的減少量可作為檢測TrxR活性的方法。Trx在TrxR的催化下，從氧化型轉(zhuǎn)變?yōu)檫€原型。還原型的Trx（Trx-（SH）2）能夠還原許多失活蛋白質(zhì)的二硫鍵，從而恢復失活蛋白質(zhì)的生物活性。通過TrxR的作用，Trx在氧化型和還原型2種狀態(tài)中轉(zhuǎn)化，構(gòu)成了機體內(nèi)氧化還原反應的良性循環(huán)［13］。

1.3.2 調(diào)節(jié)細胞增殖

還原型Trx可刺激肝細胞、成纖維細胞、腫瘤細胞、淋巴細胞等多種細胞增殖。Trx能啟動轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合，過量表達Trx可促進核因子NF-κB的反式激活。TrxR的活性直接決定還原型Trx在機體中的含量，因此TrxR在細胞增殖中有著重要作用。細胞增殖關鍵步驟的核酸代謝，TrxR作為核糖核苷酸還原酶轉(zhuǎn)運體，從NADPH處接受電子，將核糖核苷酸轉(zhuǎn)化為脫氧核糖核苷酸，從而形成DNA。有研究者為了驗證TrxR的細胞增殖作用，將野生型和半胱氨酸突變型的TrxR基因進行比較，發(fā)現(xiàn)突變型的TrxR因缺乏硒半脫氨酸殘基，有效地抑制了TrxR還原氧化態(tài)的Trx；同時突變型的TrxR基因表達的細胞增殖速度明顯較野生型降低［14］。Wipf等［15］研究證實，螺環(huán)酮縮醇衍生物作為TrxR抑制劑，在乳腺癌患者中使用，檢測出乳腺癌細胞中TrxR表達下降，同時乳腺癌細胞MDA-MB-231和MCF-7生長呈明顯抑制狀態(tài)。在體外培養(yǎng)細胞宮頸癌Hela、肝癌Bel-7402、鼻咽癌KB及胃癌BGC-823中，加入TrxR抑制劑——新型有機硒化合物1,2-［二（1,2-苯并異硒唑-3（2H）-酮）］乙烷（BBSKE），結(jié)果發(fā)現(xiàn)各組細胞生長抑制率明顯高于對照組，且TrxR活性下降率與細胞生長抑制率呈正相關。

1.3.3 抗氧化應激

氧化物和抗氧化物在細胞內(nèi)的平衡對于細胞的功能、調(diào)節(jié)和適應各種生長條件是極為重要的。活性氧（reaetiveoxygenspeeies，ROS）是機體有氧代謝的一個有毒產(chǎn)物，過量產(chǎn)生可能會導致氧脅迫，使細胞發(fā)生不可修復的損傷，最終導致細胞凋亡。線粒體是生理和病理狀態(tài)下活性氧的的主要來源，而TrxR2主要分布在線粒體中。有研究［16］證實，缺乏TrxR2的的大鼠由于增加的氧化應激而在胚胎期死亡，部分能夠存活的小鼠也表現(xiàn)出線粒體功能低下，對誘導的氧化應激損傷較正常組更為敏感。Kabuyama等［17］研究發(fā)現(xiàn)，類風濕性關節(jié)炎患者滑膜細胞中ROS含量增加，提示滑膜細胞通過氧化應激程度升高，同時滑膜細胞中TrxR1蛋白水平上調(diào)，滑膜細胞通過TrxR1蛋白水平的上調(diào)，抑制了其凋亡，抵抗氧化應激對細胞的損傷。4-羥壬烯醛（4-HNE）能通過提高TrxR活力和mRNA水平，誘導適應性反應和加強PC12細胞的耐受力，保護細胞防御氧化應激。

1.3.4 調(diào)節(jié)細胞凋亡

TrxR活力被抑制能迅速誘導細胞死亡，TcrxR的活力依賴于硒半脫氨酸的活性位點。TrxR中的硒半脫氨酸殘基具有很高的親和性，能夠與親電子化合物結(jié)合形成硒半脫氨酸修飾的TrxR衍生凋亡蛋白（selenium compromised thioredoxin reductasedercived apoptotic proteins，secTRAPs），從而能有效和直接地誘導細胞死亡，這種細胞死亡具有凋亡和壞死2個特征。Lindner等［18］分離出與RA-IFN誘導細胞死亡相關的基因GRIM，結(jié)果顯示:GRIM-12編碼了TrxR，反之抑制了TrxR，細胞死亡效應也明顯減弱。Trx的還原活性在TNF/ASKI誘導的非JNK依賴的凋亡通路中起到?jīng)Q定作用。TrxR被抑制后，細胞將通過恢復還原型的Trx及其他抗氧化酶的活力 （包括TrxR），和以壞死或凋亡表現(xiàn)的細胞死亡來響應。在乳腺癌細胞中分離出野生型和突變型，并植入無胸腺的大鼠中，對大鼠進行干擾素-β（IFN-β）和全反式維甲酸（ATRA）聯(lián)合治療。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，野生型TrxR的腫瘤被聯(lián)合作用所抑制消退，相反，突變型TrxR的腫瘤不消退，同時在消退的腫瘤中標記到凋亡信號。也有研究［19］將TrxR進行突變分析，即去除C-末端的結(jié)構(gòu)域，結(jié)果激活了TrxR依賴的死亡效應，并促進了p53依賴的基因表達。

1.3.5 調(diào)節(jié)其他生理過程

抗壞血酸是血漿和細胞膜內(nèi)重要的抗氧化劑。它能還原a-生育酚，過氧化物和活性氧，能預防動脈粥樣硬化斑塊的形成。抗壞血酸自由基的再循環(huán)需TrxR來完成。長期給予大鼠低硒飲食，可發(fā)現(xiàn)肝細胞中抗壞血酸鹽、谷胱甘肽過氧化酶和TrxR水平降低。Curbo等［20］發(fā)現(xiàn)，由脂多糖和Hela細胞誘導的單核細胞能夠?qū)L-4的二硫鍵還原為巰基。同時加入不同濃度的TrxR阻滯劑金諾芬，結(jié)果顯示:高濃度組的金諾芬二硫鍵數(shù)目明顯高于低濃度組和對照組，說明TrxR能夠還原IL-4，阻斷其信號傳導通路。

2 TrxR與循環(huán)系統(tǒng)疾病

2.1 冠狀動脈粥樣硬化性心臟病

有研究［21］表明，氧化應激和炎癥在冠心病的發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用。炎性條件下生成的活性氧不僅能導致血管細胞凋亡及血管張力喪失，而且能誘導多種趨化因子（如MCP-1）和血管黏附分子（如VCAM-1和ICAM-1）的表達，進而加重炎癥反應的進程。其中動脈粥樣硬化的危險因素包括高同型半胱氨酸血癥（HCY）、高血糖、高血脂等。為了解Trx、TrxR和同型半胱氨酸與冠心病的聯(lián)系，Wu等［22］收集了150例冠心病患者并使用他汀類藥物和122例無冠心病的正常人。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比正常組，冠心病組顯著增加了TrxR的活性和HCY水平。根據(jù)HCY再進一步分組，Trx活性在HCY＜15組中明顯降低，與HCY水平呈負相關，但是與TrxR活性無明顯相關。血糖、血脂均不能顯著影響Trx和TrxR活性。從而得出結(jié)論，在冠心病患者中，高HCY水平能導致Trx活性的降低，并與冠心病的程度和嚴重性緊密相關。Trx在多種心血管病變的組織中均有較高的表達。用原位雜交和免疫組化的方法發(fā)現(xiàn)人動脈粥樣硬化斑塊（特別是內(nèi)皮和巨噬細胞）中Trx的mRNA和蛋白水平均有顯著增高。除了Trx，人的冠狀動脈粥樣硬化組織標本中存在高表達的谷氧還蛋白（Grx）。此外，球囊損傷所致大鼠動脈新生內(nèi)膜中也存在著高表達的Trx［23］。這些發(fā)現(xiàn)均提示動脈粥樣硬化及血管新生內(nèi)膜增生受到氧化還原狀態(tài)的調(diào)節(jié)，而Trx和Grx這2個二硫鍵還原酶在此過程中可能發(fā)揮著重要的作用。

2.2 高血壓病

高血壓病的發(fā)生、發(fā)展與ROS的過度生成造成氧化應激和（或）機體內(nèi)抗氧化能力降低密切相關。循環(huán)系統(tǒng)ROS的來源主要有氧化酶、解耦聯(lián)的內(nèi)皮型一氧化氮合酶。特別是NADPH氧化酶被視為高血壓病理過程中ROS的主要來源。機體抗氧化系統(tǒng)能力的降低直接導致高血壓患者的氧化應激損傷。清除ROS，從而維持細胞的還原狀態(tài)和抑制心室重構(gòu)至關重要。多數(shù)高血壓患者存在著抗氧化酶活性下降和含量降低的情況，如超氧化物歧化酶（superoxide dis-mutase，SOD），谷胱甘肽氧化酶和過氧化氫酶等。ROS水平的升高導致氧化應激水平增加會誘導血壓的升高，而高血壓又會進一步促進ROS的生成增加和組織氧化損傷。最近的研究［24］表明，血管緊張素Ⅱ （angiotensinⅡ，AngⅡ）可激活NADPH氧化酶，導致線粒體的功能障礙，促使線粒體產(chǎn)生過剩的 ROS，如過氧化物（O2-）、H2O2和過氧亞硝基。ROS通過減少NO生物利用度和活化凋亡信號使內(nèi)皮功能產(chǎn)生障礙，從而促進高血壓病的發(fā)生。在心臟TrxR不僅作為主要的抗氧化物，而且能與許多重要的信號分子和轉(zhuǎn)錄因子相互作用，從而調(diào)節(jié)各種細胞的功能。而TrxR2主要存在于線粒體中，在AngⅡ誘導的高血壓及心肌肥大等方面起著重要作用。Matsushima等［25］研究證實，高表達的TrxR2大鼠在心肌損傷后能夠有較好的預后。同時，也有研究［26］證實，利用高表達TrxR2的轉(zhuǎn)基因大鼠，證實在AngⅡ誘導的高血壓中,TrxR2表達上調(diào)，且NADPH氧化酶表達和線粒體源性ROS產(chǎn)量減少，從而保留了NO的生物利用度，維持內(nèi)皮細胞功能。有研究顯示，心臟中的內(nèi)源性TrxR基因沉默后會增加氧化應激和心肌肥厚的概率［27］，急性抑制TrxR會消除預處理治療所誘導的心肌保護效應。

2.3 心肌炎

心肌炎的發(fā)生發(fā)展與ROS密切相關，ROS清除劑能明顯改善心肌炎的癥狀。低硒可以降低許多臟器TrxR的活性。長期低硒喂養(yǎng)，大鼠肝、腎等組織中的TrxR活性明顯下降，而腦、脾、前列腺中TrxR活性無明顯改變，說明肝、腎TrxR活性對硒營養(yǎng)敏感，而腦、脾、前列腺等組織敏感性較差。滕宗艷等［28］采用低硒飼料喂養(yǎng)大鼠14周，大鼠心肌中TrxR活性降低到對照組的63.18%，說明心肌TrxR活性對硒營養(yǎng)較敏感。進一步應用Western blot雜交檢測心肌中TrxR的蛋白表達水平后發(fā)現(xiàn)，低硒組蛋白水平較對照降低，提示長期低硒心肌TrxR活性降低是由于酶特異活性降低和蛋白合成減少所致，推測可能是硒元素以SeCys形式插入減少引起的。心肌中TrxR活性降低，導致酶的還原功能減弱，使心肌抗氧化能力降低，易受損傷。因此，低硒心肌損傷的發(fā)生與TrxR功能障礙有關。一些藥物可能通過上調(diào)硫氧還蛋白的表達以實現(xiàn)其細胞保護作用。替莫普利是一種血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑，用它處理大鼠能增加心肌中Trx的表達。替莫普利能減輕大鼠自身免疫性心肌炎的損傷程度，很可能與Trx的抗氧化功能有關［29］。

3 小結(jié)

綜上所述，TrxR在維持循環(huán)系統(tǒng)的生理功能和保護機體細胞免受各種病理情況下的氧化損傷中起著重要的作用。深入研究TrxR在循環(huán)系統(tǒng)疾病發(fā)生過程中的機制以及在信號傳導過程中的作用尤為關鍵，這對更好地利用TrxR預防和治療循環(huán)系統(tǒng)疾病具有重要指導意義。

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