松花粉預防和延緩腮腺組織衰老IGF-1在導管細胞中的表達*

劉紅艷，張 晗，孫秀娟，李艷杰，王春艷，顏 勇

(1.承德醫學院附屬醫院，河北 承德 067000 2.河北省承德市中心醫院，河北 承德 067000 3.承德醫學院，河北 承德 067000)

我國已步入老齡化社會，60歲以上的老齡人今年 已達1.85億，明年將突破2億。延年益壽，抗衰老提高老年人的生活質量迫在眉睫。既往抗衰老的研究多集中在心、腦、血管方面，在眼、生殖系統方面也多見報道［1，2］。但有關松花粉預防和延緩腮腺衰老作用的研究國內甚少。本實驗應用不同劑量松花粉，對D－半乳糖所致亞急性衰老大鼠腮腺組織IGF－1的表達進行研究，觀察松花粉對衰老大鼠腮腺功能的影響，探討松花粉預防和延緩腮腺組織衰老作用的機制，為篩選抗腮腺衰老中藥提供實驗依據。

1 資料和方法

1.1 實驗動物及分組：選清潔級8周齡雄性SD大鼠90只(由北京大學醫學實驗動物科學部提供)。體重180－220g，隨機分成9組，正常組(10只);松花粉預防組(中、低劑量組各10只);模型組(10只)，松花粉延緩衰老組(高、中、低劑量組各10只)，陰性對照組(10只)，VE陽性對照組(10只)。

1.2 方 法

1.2.1 藥品與試劑：松花粉購于中國新時代集團，D－半乳糖購于北京化學試劑公司，IGF－1檢測試劑盒購于北京中杉金橋生物有限公司。

1.2.2 模型建立：SD大鼠按200mg·kg－1·d－1腹腔注射D－半乳糖(用生理鹽水配成5%的溶液)，除正常組外，其余各組均連續用藥50d，每天1次，制備亞急性衰老動物模型。

1.2.3 用藥方法：松花粉用1%羧甲基纖維素鈉稀釋，高、中、低劑量分別按1400、700、350 mg·kg－1·d－1灌胃，陽性對照組用維生素E按35 mg·kg－1·d－1灌胃給藥。預防組在注射D－半乳糖的同時灌胃松花粉，連續50d，每日1次。延緩衰老組、陽性對照組、陰性對照組大鼠在造模成功后每天灌胃松花粉、維生素E和生理鹽水，連續50d，每日1次。

1.2.4 IGF－1表達的檢測：將正確取材常規固定、包埋的腮腺組織塊連續切片，常規做免疫組織化學染色(SP法)，顯微鏡下觀察。結果判定：細胞胞漿染成棕黃色粗顆粒或細顆粒彌散分布為陽性反應細胞。定量數據處理：用圖像分析系統進行細胞計數，每個標本檢查3張切片，每張切片檢查10個高倍視野，隨機選取組織結構保存較好的部位，每個視野計數陽性細胞數和陰性細胞數，計算免疫陽性細胞的百分比。

1.3 統計學處理：將IGF－1檢測結果建立數據庫，用SPSS統計軟件進行統計學處理。用t檢驗和q檢驗進行分析。

2 結果

IGF－1的表達：模型組表達量明顯減少，與正常組相比有顯著性差異(P＜0.01)，與陰性對照組、松花粉延緩衰老高劑量組接近(P＞0.05)，而松花粉預防中劑量組和松花粉延緩衰老中、低劑量組IGF－1的表達均明顯增高(P＜0.01)(圖1，2，3)其中松花粉預防中劑量組表達效果最顯著。松花粉延緩衰老中劑量組的效果又好于延緩衰老高、低劑量組、VE陽性對照組(P＜0.05)。見表1。

表1 實驗組大鼠腮腺IGF-1在導管細胞中的表達(±s，n=10)

表1 實驗組大鼠腮腺IGF-1在導管細胞中的表達(±s，n=10)

與模型組比較：1)P＜0.01，2)P＞0.05;與預防中劑量組比較：3)P＜0.01，與延緩衰老中劑量組比較4)P＜0.05

組別 IGF－1陽性細胞百分率(%)正常組 30.11±2.151)模型組 6.43±1.80預防低劑量組 28.61±3.121)3)預防中劑量組 58.39±2.721)3)延緩衰老低劑量組 26.52±1.871)3)4)延緩衰老中劑量組 40.34±2.241)3)4)延緩衰老高劑量組 15.85±3.182)4)陽性對照組 23.97±1.75 4)陰性對照組 12.19±1.362)

圖1 預防中劑量組IGF－1的表達(200×)

圖2 延緩衰老低劑量組IGF－1的表達(200×)

圖3 延緩衰老中劑量組IGF－1的表達(200×)

圖1－圖4顯示：在同一高倍鏡(200×)下，松花粉預防中劑量組、松花粉延緩衰老組(低、中、高劑量)IGF－1在腮腺導管細胞中的表達情況。其中松花粉預防中劑量組IGF－1表達陽性率最高，其次是松花粉延緩衰老中劑量組、松花粉延緩衰老低劑量組、松花粉延緩衰老高劑量組。

圖4 延緩衰老高劑量組IGF－1的表達(200×)

3 討論

衰老模型的選擇：本研究依照劉學麗［3］等報道對SD大鼠以腹腔注射方式給藥，并應用D－半乳糖成功建立了D－半乳糖誘發的亞急性衰老動物模型［4］，使得各實驗組同等起始，具有良好的可比性，實驗結果更可靠。

松花粉的抗衰老作用：松花粉藥名松黃，作為傳統醫藥寶庫中的傳統藥材，在古代文獻中早有記載。松花粉含有20種氨基酸(8種人體必需氨基酸)，14種維生素，30種礦物質等，數量達200余種。有研究報道松花粉能夠有效降低血脂，促進鋅的吸收利用［5］;松花粉作用于人肺成纖維細胞能明顯促進細胞群體倍增水平，降低細胞死亡數目［6］。此外Giovannini［7］等研究顯示，增齡可使血液中IGF－1濃度降低。健康的老年人血液中IGF－1水平較年輕人低30%－40%。

本研究經觀察各實驗組大鼠腮腺IGF－1在導管細胞中的表達情況，用免疫組織化學方法(SP法)證實大鼠腮腺組織IGF－1廣泛表達，陽性產物位于腮腺導管細胞的胞漿中。結果表明：松花粉預防用藥的效果優勢明顯，其中預防中劑量組效果最佳;松花粉延緩衰老中劑量組的效果明顯好于延緩衰老高、低劑量組、VE陽性對照組，其中松花粉延緩衰老高劑量組效果最差。本研究提示松花粉能提高腮腺導管細胞IGF－1的表達，證實松花粉能促進腮腺導管細胞分泌IGF－1，對預防和延緩腮腺組織衰老具有調節作用;針對松花粉抗衰老預防用藥，臨床我們提倡應用中劑量為佳。

［1］ 吳賽珠，譚家余，周忠江，等.性激素通過影響血脂、細胞免疫功能及氧化/抗氧化系統影響衰老［J］.嶺南心血管病雜志，2004，10(1)：10－16.

［2］ 牛嗣云，龐曉靜，陳龍，等.松花粉對亞急性衰老模型大鼠抗衰老作用的實驗研究［J］.中國老年學雜志，2005，25(12)：1504－1506.

［3］ 劉學麗，朱延勤，潘偉娜，等.對大鼠半乳糖性白內障實驗模型的探討［J］.北京實驗動物科學與管理，1994，11(2)：2－3.

［4］ 顧以芍.實驗性D－半乳糖誘發動物白內障造膜的探討［J］.徐州醫學院學報，1987，(1)：12－16.

［5］ 趙霖，鮑善芬，U Eidelsbutg，等.松花粉對缺鋅幼鼠營養作用的實驗研究［J］.營養學報，2000，22(1)：14－17.

［6］ 趙立新，喻陸.松花粉對人肺成纖維細胞增殖活性影響的實驗研究［J］.東南大學學報，2004，23(2)：79－81.

［7］ Giovannini S，Marzetti E，Borst SE，et al.Modulation of GH/IGF－1axis：Potential strategies to counteract sarcopenia in older adults［J］.Mech Ageing Dev，2008，129(10)：593.