清開靈注射液對小鼠TB細胞增殖與功能的影響*

邢恩鴻，邵雪齋，張 麗，王 睿，王旭丹

(1.承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院，河北 承德 067000 2.北京中醫(yī)藥大學免疫學教研室，北京 100029 3.北京理工大學，北京 100081)

清開靈是在“安宮牛黃丸”的基礎(chǔ)上研制成的一種純中藥制劑。在臨床上主要用于治療感染性疾病、腦血管疾病、傳染性疾病［1－3］，近年來在治療急慢性肝炎、類風濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病方面，均取得良好療效［4，5］。在治療機理基礎(chǔ)研究方面，主要集中于腦血管疾病、感染、發(fā)熱性疾病等方面，對清開靈免疫調(diào)節(jié)作用機制的研究相對滯后［6－8］。本文旨在初步探討清開靈體內(nèi)對小鼠T、B細胞增殖與功能的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑：試劑：清開靈注射液由北京中醫(yī)藥大學藥廠生產(chǎn)，人平均用藥量20－40mL/d(0.67mL.kg－1.d－1)，小鼠用藥量定為3.35、6.70、13.33mL/kg/d 3個劑量組，分別相當于臨床人用藥量的5、10、20倍，實驗時用無菌生理鹽水配制成所需劑量;地塞米松磷酸鈉注射液(陽性藥)：由廣州光明制藥廠提供，含藥量2mg/mL。人平均用藥量5mg/d(0.083mg·kg－1.d－1)，小鼠用藥量定為大劑量1.66mg.kg－1.d－1，相當于臨床人用藥量的20倍，實驗時用無菌生理鹽水配制成所需劑量;LPS、ConA、甲基偶氮唑鹽(MTT)均為美國Sigma產(chǎn)品;RPMI－1640培養(yǎng)液為美國Gibco產(chǎn)品;二硝基氟苯由北京化學試劑公司生產(chǎn)。動物：Babl/c小鼠，雌性，體重18－20g，購于北京維通利華實驗動物中心，清潔級。儀器：550型酶標儀(美國伯樂)。

1.2 動物分組與給藥

1.2.1 分組：將60只Balb/c小鼠采用抽簽法隨機分為6組，分別為正常對照組、DTH對照組、清開靈注射液低、中、高三個劑量組及地塞米松磷酸鈉陽性對照組，每組10只，逐只標記。

1.2.2 給藥：清開靈三劑量組及陽性藥組分別腹腔注射(i.p)給予相應(yīng)的藥物，每日一次，連續(xù)10d;正常對照組及DTH對照組腹腔注射等量的無菌生理鹽水。

1.3 實驗方法與檢測指標

1.3.1 清開靈注射液對正常Balb/c小鼠免疫器官指數(shù)的影響：實驗結(jié)束時按編號順序稱重，摘眼球取血處死小鼠，無菌摘取脾臟、胸腺，稱濕重(mg)，按下列公式計算免疫器官指數(shù)：胸腺指數(shù)=胸腺重量(mg)/體重(g)，脾臟指數(shù)=脾臟重量(mg)/體重(g)。

1.3.2 清開靈注射液對正常小鼠DTH反應(yīng)的影響：所有動物均在給藥d5腹部剃毛(3cm×3cm)后，均勻滴涂50μL配制好的致敏液(1%的DNFB溶于1：1的丙酮/色拉油中)致敏。給藥d9除正常對照組外，其余各組動物于右側(cè)耳部內(nèi)側(cè)涂1%的DNFB10μL攻擊，誘發(fā)DTH反應(yīng)，d11眼球放血處死小鼠，剪下小鼠兩耳，在耳的同一部位打孔(直徑為7mm)，天平上稱其重量，以左右耳片重量差作為DTH反應(yīng)的強度指標。

1.3.3 清開靈注射液對正常小鼠脾臟T、B淋巴細胞增殖能力的影響：將無菌摘取的脾臟，置于不完全1640培養(yǎng)液中，用50目鋼網(wǎng)研磨制成單個細胞懸液，1500rpm×5min離心，棄上清。脾臟細胞懸液用雙蒸水(低滲法)破壞紅細胞，雙鹽水恢復(fù)等滲后，200目尼龍網(wǎng)過濾，1500rpm×5min離心棄去上清。細胞懸液用完全1640培養(yǎng)液調(diào)濃度為5×106/mL，加到96孔板中，每組設(shè)8個復(fù)孔，100μL/孔，用含不同刺激物的1640完全培養(yǎng)液補足至200μL/孔(ConA刺激T細胞增殖，其終濃度為5μg/mL，LPS刺激B細胞增殖，其終濃度為50μg/mL)。將培養(yǎng)板放入37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)至72h。培養(yǎng)結(jié)束前4h每孔加入MTT溶液20μL繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后培養(yǎng)板3000rpm×5min離心，棄去上清，輕扣培養(yǎng)板，用濾紙吸去水分后，每孔加入酸化異丙醇100μL，靜置15min，輕輕混勻后，492nm波長測OD值。

2 結(jié)果

2.1 清開靈注射液對正常Balb/c小鼠免疫器官的影響：用藥后d11時，處死小鼠，測定胸腺及脾臟指數(shù)。

2.1.1 胸腺指數(shù)：清開靈注射液大、中兩個劑量組及地塞米松組均明顯低于正常對照組，存在極顯著性差異(P＜0.01);小劑量組胸腺指數(shù)雖有減小趨勢但無統(tǒng)計學意義。見表1。

表1 清開靈注射液對正常小鼠胸腺指數(shù)及脾指數(shù)的影響(±s)

表1 清開靈注射液對正常小鼠胸腺指數(shù)及脾指數(shù)的影響(±s)

注：與正常對照組比較：*P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別 動物數(shù) 胸腺指數(shù)(mg/g)脾指數(shù)(mg/g)正常對照組 10 2.61±0.47 4.87±0.57清開靈小劑量組 10 2.34±0.40 4.92±0.63清開靈中劑量組 10 2.02±0.33＊＊ 5.34±0.28清開靈大劑量組 10 0.69±0.25＊＊ 5.40±0.63地塞米松組 10 0.69±0.25＊＊2.53±0.20＊＊

2.1.2 脾臟指數(shù)：清開靈注射液三個劑量組與正常對照組相比差異均不顯著;地塞米松組脾臟指數(shù)與正常對照組相比則顯著降低，存在極顯著性差異(P＜0.01)。見表2。

2.2 清開靈注射液對正常小鼠DTH反應(yīng)的影響：小鼠經(jīng)致敏液致敏及攻擊后DTH反應(yīng)十分強烈，攻擊側(cè)耳腫脹非常明顯，DTH組與正常對照組相比，差異極顯著(P＜0.001);三個劑量的清開靈注射液均能明顯抑制其DTH反應(yīng)，與DTH組相比，差異顯著(P＜0.05);地塞米松組對小鼠DTH反應(yīng)的抑制作用最為明顯(P＜0.01)。詳見表2。

表2 清開靈注射液對小鼠DTH反應(yīng)的抑制作用(±s)

表2 清開靈注射液對小鼠DTH反應(yīng)的抑制作用(±s)

注：與正常對照組比較：*P＜0.05，＊＊P＜0.01，＊＊＊P＜0.001;與DTH組比較：△P＜0.05，△△P＜0.01，△△△P＜0.001

組別 動物數(shù) 耳腫脹差值(μg)正常對照組 10 －0.40±1.43△△△DTH對照組 10 55.70±18.73＊＊＊清開靈小劑量組 10 29.44±10.60＊＊＊△清開靈中劑量組 10 32.00±10.22＊＊△清開靈大劑量組 10 27.64±13.89＊＊＊△地塞米松組 10 18.45±9.20＊＊＊△△

2.3 清開靈注射液對正常小鼠脾臟T、B淋巴細胞增殖能力的影響

2.3.1 對脾臟T淋巴細胞增殖能力的影響：清開靈注射液三個劑量組均可明顯降低正常小鼠由ConA刺激的T細胞非特異性增殖反應(yīng)，其中以大劑量組作用最為明顯，和正常組相比，差異極顯著(P＜0.001)。地塞米松組同樣表現(xiàn)了強烈的抑制作用(P＜0.001)。見表3。

2.3.2 對脾臟B淋巴細胞增殖能力的影響：清開靈注射液三個劑量組與正常組相比，均無顯著性差異;地塞米松組與正常組相比則表現(xiàn)出顯著的抑制作用(P＜0.05)。見表3。

表3 清開靈注射液對正常小鼠脾臟T、B淋巴細胞增殖能力的影響(±s)

表3 清開靈注射液對正常小鼠脾臟T、B淋巴細胞增殖能力的影響(±s)

注：與正常對照組比較：*P＜0.05，＊＊P＜0.01，＊＊＊P＜0.001

組別 動物數(shù) 脾臟T細胞OD值脾臟B細胞OD值正常對照組 10 0.671±0.049 0.206±0.035清開靈小劑量組 10 0.534±0.050＊＊＊ 0.223±0.052清開靈中劑量組 10 0.390±0.053＊＊＊ 0.234±0.041清開靈大劑量組 10 0.252±0.019＊＊＊ 0.242±0.037地塞米松組 10 0.242±0.037＊＊＊0.160±0.022*

3 討論

T細胞來源于骨髓，在胸腺內(nèi)發(fā)育成熟，隨后移行至脾等外周淋巴器官及組織，執(zhí)行特異性細胞免疫應(yīng)答，并在TD－Ag誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。DTH反應(yīng)是由效應(yīng)T細胞與相應(yīng)抗原作用后，引起的以單個核細胞浸潤和組織損傷為主要特征的炎癥反應(yīng)，反映機體的細胞免疫狀態(tài)［9］。

本實驗結(jié)果表明清開靈對胸腺指數(shù)有明顯的減小作用。胸腺作為中樞淋巴器官是T細胞分化發(fā)育的場所，胸腺指數(shù)的異常減小可能影響T細胞的分化及發(fā)育，造成成熟T細胞的數(shù)量減少及功能受損。

T細胞功能檢查發(fā)現(xiàn)，清開靈三個劑量組均能抑制小鼠的DTH反應(yīng)。表明清開靈可抑制由DNFB誘發(fā)的正常小鼠的T細胞特異性的增殖反應(yīng)。與趙令齋等的實驗結(jié)果相一致［9］。清開靈還可強烈抑制ConA刺激的脾T淋巴細胞的增殖反應(yīng)。提示清開靈也可抑制正常小鼠的T細胞非特異的增殖反應(yīng)。

B細胞是除T細胞外機體執(zhí)行適應(yīng)性免疫應(yīng)答的主要免疫細胞。B細胞不僅能通過產(chǎn)生抗體發(fā)揮特異性體液免疫功能，也是重要的抗原提呈細胞。本研究結(jié)果表明清開靈對正常小鼠的脾指數(shù)無明顯影響，清開靈對由絲裂原的非特異刺激所引發(fā)的正常小鼠B細胞增殖反應(yīng)亦無明顯影響。說明清開靈在體內(nèi)對正常小鼠的B細胞并無顯著影響。

［1］ 傅紅英.清開靈聯(lián)合抗生素治療慢性支氣管炎急性發(fā)作40例［J］.浙江中醫(yī)雜志，2010，(6)：423.

［2］ 陳偉，袁媛，何龍泉，等.清開靈注射液對高血壓腦出血全身炎性反應(yīng)綜合征的干預(yù)作用［J］.中醫(yī)藥臨床雜志，2005，17(5)：463－464.

［3］ 孫建業(yè).清開靈注射液直腸給藥退熱的療效觀察［J］.中國醫(yī)藥指南，2008，6(16)：586

［4］ 劉德芳，郭明陽，劉太華，等.注射用清開靈聯(lián)合中藥治療類風濕關(guān)節(jié)炎活動期的臨床研究［J］.中國醫(yī)院用藥評價與分析，2009，9(1)：64－66.

［5］ 李冬華，清開靈聯(lián)合葡醛酸鈉治療病毒性乙型肝炎的臨床研究［J］.今日藥學，2012，22(1)：41－42.

［6］ 龐春紅，李澎濤，朱曉磊.缺血－再灌注相關(guān)細胞因子表達的TNF－α損傷機制及清開靈的作用［J］.世界中醫(yī)藥，2011，6(4)：343－346.

［7］ 曹春雨，梁愛華，趙雍，等.清開靈注射液的抗血栓作用及其機制研究［J］.中國中藥雜志，2009，34(12)：1549－1550.

［8］ 黃良勝.清開靈注射液解熱抗炎作用的實驗研究［J］.臨床合理用藥，2012，5(1C)：6－7.

［9］ 金伯泉，熊思東.醫(yī)學免疫學［M］.第5版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2009.2－3.