急性胎兔宮內窘迫模型腦組織病理及NMDAr1表達實驗研究

林也容 林進皇 吳芳芳 郁毅剛▲

1.解放軍第一七五醫院暨廈門大學附屬東南醫院婦產科，福建漳州 363000；2.解放軍第一七五醫院暨廈門大學附屬東南醫院神經外科，福建漳州 363000

胎兒在宮內有缺氧征象危及胎兒健康和生命者，稱為胎兒窘迫（fetal distress，FD）[1]，是胎兒圍產期死亡及新生兒神經系統后遺癥的常見原因，占圍產兒死亡原因的首位[2]，給社會、家庭和個人帶來沉重負擔。深入研究FD的發病機制，包括病理生理機制和分子機制，具有重要的意義。本研究通過建立急性胎兔宮內窘迫模型，觀察研究其胎兔腦組織病理及NMDAr1表達情況。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

健康成年新西蘭大白兔4周左右孕兔，普通級。體質量3.2～3.7kg，由上海松江松聯實驗動物場生產，廈門大學醫學院動物中心提供。動物許可證：SCXK（滬）2007-0011。實驗動物使用單位許可證編號：SYXK（軍）2002-47。動物實驗人員資質許可證編號：軍動管字第2006E01028。實驗孕兔飼養3d，每日傍晚測體溫、脈搏、呼吸1次。至孕32～34d實驗，剔除異常極值動物，經統計分析，個體間無明顯差異。編號按隨機表分成3組，缺血模型組9只，假手術組9只，空白組12只。

1.2 實驗方法

模型制作：妊娠34d孕兔以2.5%戊巴比妥鈉0.1mL/100g進行腹腔麻醉后，恥區下腹部正中切口打開腹腔，暴露雙側子宮角，檢查胎盤、子宮及孕兔活力。分離出進入每個胎盤的分支動脈血管，以無創動脈夾鉗夾20min，然后松開血管夾，恢復血流，建立急性胎兔宮內窘迫模型。缺血模型組孕兔行開腹子宮動脈結扎術，建立胎兔宮內窘迫缺血缺氧模型；假手術組孕兔行開腹術，不結扎子宮動脈；空白組孕兔不行任何手術處理。除空白組胎兔直接斷頭取腦外，其他組胎兔均在手術處理后6h斷頭處死、取腦，固定，顯微鏡下觀察各組胎兔腦組織病理形態及NMDAr1表達情況。

1.3 腦組織病理檢測

取4%甲醛固定腦組織，石蠟包埋，切片行HE染色，光鏡下觀察形態學變化，由同一病理醫生采用盲法評價。觀察腦組織結構層次是否完整，神經細胞腫脹、變性、壞死，間質出血、水腫等情況。

1.4 腦組織NMDAr1免疫組化表達的測定

取4%甲醛固定腦組織，石蠟包埋，連續切片（4μm），每例標本切5張免疫組化染色用。采用改進型SP法進行免疫組化染色，嚴格參照試劑盒說明操作。試劑盒型號，購于XX公司。每次染色時均用已知陽性切片作陽性對照，用PBS（磷酸緩沖液，0.01mol/L，pH值7.2）代替一抗作陰性對照。NMDAr1表達均位于胞質和胞核內，表現為淺黃、棕黃或棕褐色。用半定量法評估其染色，無陽性細胞數為（-），陽性細胞數 25% 以下為（+），25%～50% 為（++），51%～75%為（+++），超過 75% 為（++++）。

2 結果

2.1 腦組織HE染色結果

HE染色空白組胎兔腦組織切片示，腦皮質各層發育正常，其中分子層，內顆粒層、外顆粒層以及錐體細胞層均勻致密，完整；錐體細胞數量中等，胞體較小致密，軸突干凈完整、延伸，胞核居中。白質間少量血管，肌漿紅染，膠質豐富；血管腔內可見紅細胞（圖1～2）。假手術組腦組織切片HE顯示，各層結構存在，錐體細胞數量中等，基本同空白組。胞體稍腫脹，未見明顯空泡變性，軸突完整，光滑延伸；細胞間偶見少量紅細胞，無明顯間質炎細胞浸潤（圖3～4）。HE染色缺血模型組切片示，胎兔腦皮層組織結構層紊亂，部分壞死崩解，分界不清；錐體胞胞體腫脹，數量稀少，單細胞體積明顯增大，形態不規則，邊緣較毛糙，胞膜胞質融合。軸突斷裂崩解，白質稀疏；間質充血水腫，散在紅細胞及漿細胞浸潤（圖 5～6）。

圖1 空白組HE染色（×100）

圖2 空白組HE染色（×400 ）

圖3 假手術組HE染色（×100）

圖4 假手術組HE染色(×400）

圖5 缺血模型組HE染色（×100）

圖6 缺血模型組HE染色（×400 ）

2.2 腦組織NMDAr1免疫組化的表達

各組胎兔腦切片神經元錐體細胞均有NMDAr1表達，主要在神經元膜表面表達，免疫反應強度有差異。空白組見神經元形態完整、胞膜淡染，NMDAr1蛋白少量表達（+）（圖7～8）。假手術組，與空白組基本一致，胞體結構完整，數量中等，細胞膜不典型黃染（+），NMDAr1少量表達（圖9～10）。缺血模型組可見神經元壞死崩解，少量殘存神經元形態粗糙，胞體腫脹，體積巨大，胞核溶解，大部分胞質、胞膜均黃染，色深；NMDAr1大量表達（+++）（圖11～12）。空白組和假手術組NMDAr1免疫反應強度均低于缺血模型組，缺血模型組NMDAr1蛋白呈神經元膜及胞漿內強性表達 。

圖7 空白組Nr1組化（×100）

圖8 空白組Nr1組化(×400）

圖9 假手術組Nr1組化（×100）

圖10 假手術組Nr1組化(×400）

圖11 缺血模型組Nr1組化（×100 ）

圖12 缺血模型組Nr1組化（×400）

3 討論

胎兒宮內窘迫是由于胎兒缺血缺氧所引起，可發生在臨產后，也可發生在妊娠期，是導致死胎死產主要原因之一[3]，可分為急性胎兒窘迫和慢性胎兒窘迫[4]。研究急性宮內窘迫腦組織病理形態有助于腦缺血缺氧性損傷病理生理機制的深入了解，對該病的積極治療和改善預后等發展亦具有相當重要的意義。

本實驗研究中，我們選擇了與人解剖及生理相似程度較高的兔子作為實驗對象，通過對缺血模型組孕兔行開腹子宮動脈結扎術，建立急性胎兔宮內窘迫模型。在術后6h斷頭取腦，固定后HE染色，顯微鏡下發現胎兔腦皮層組織結構層紊亂，部分壞死崩解，分界不清；錐體胞體腫脹，數量稀少，單細胞體積明顯增大，形態不規則，邊緣較毛糙，胞膜胞質融合。軸突斷裂崩解，白質稀疏；間質充血水腫，散在紅細胞及漿細胞浸潤。而只行開腹術不行子宮動脈結扎的假手術組胎兔腦病理組織形態與缺血模型組差異明顯，而與空白組基本相同，腦皮質各層結果存在，其中分子層，內顆粒層、外顆粒層以及錐體細胞層均勻致密，完整；錐體細胞數量中等，胞體稍腫脹，未見明顯空泡變性，軸突完整，光滑延伸；細胞間偶見少量紅細胞，無明顯間質炎細胞浸潤。本實驗中，缺血模型組胎兔的神經病理改變情況與郭世杰等[5]研究報告的相似，所以該模型可成功復制急性宮內窘迫癥，病理形態表現明顯，能夠幫助我們更好觀察研究其病理生理過程。

除了病理觀察，我們還對胎兔腦神經元錐體細胞進行免疫組化染色，發現各組均有NMDAr1表達，主要在神經元膜表面表達，免疫反應強度差異較明顯。假手術組與空白組基本一致，NMDAr1均少量表達，而缺血模型組NMDAr1大量表達（+++）。缺血模型組NMDAr1免疫反應強度高于空白組和假手術組，其神經元膜及胞漿內呈強陽性。由此不難看出，缺血模型組的病理學損傷伴隨著NMDAr1蛋白表達，我們可以推斷NMDA受體的高表達和激活導致腦組織缺血缺氧性損傷，這與早期實驗研究結果基本一致[6-7]。

NMDA受體由 3種亞基組成： NR1、NR2（A-D）和NR3（A-B）[8]。NR1是能單獨構成離子通道的功能亞基，而NR2和NR3是不能單獨構成離子通道的調節亞基，分別增強或抑制NR1亞基的功能。NR1和NR2的表達是NMDA受體發揮功能所必需的，NR3則不是NMDA受體發揮功能所必需的[9]。因此，NMDArl蛋白表達的變化可反映NMDAr蛋白表達的變化。胚胎期或新生期腦組織內NMDA受體表達量較其他時期高，這對于腦發育如學習和記憶等非常重要。但當損傷因素存在時NMDA受體的過高表達又可損傷神經系統，因此NMDAR表達具有“雙刃劍”作用[10]。本研究也證實了當出現急性宮內窘迫時，胎兔的腦組織內代表NMDA受體的NMDAr1表達顯著增高，這是胎兔腦組織損傷的關鍵機制之一。

急性宮內窘迫常致缺血性腦損傷，其機制錯綜復雜，NMDA受體的過度激活是其中關鍵點之一，是損傷后諸多繼發性病理改變的初始“鑰匙”環節[11]。作為一種興奮性氨基酸的特異性離子型受體，當NMDA受體被過度激活時，大量Ca2+流入細胞內，進而觸發一系列生化過程[12]： 激活依賴Ca2+的蛋白水解酶；激活磷酸脂酶C、A1、A2，使膜磷脂水解，花生四烯酸釋放增加；使神經遞質DA釋放增加；自由基大量形成，線粒體氧化磷酸化脫偶聯，細胞呼吸抑制；激活核酸內切酶，引起DNA分解。這些生化過程最終促使了神經元壞死和凋亡等病理改變[13]，與本實驗的病理結果一致。

綜上，通過建立急性宮內窘迫模型，觀察到了腦組織NMDAr1表達及病理損傷情況，為NMDA受體過度激活致腦組織損傷提供理論依據，對于進一步深入研究急性宮內窘迫腦組織損傷機制具有重要意義。

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