T-SPOT.TB技術檢測胸腔積液在結核性胸膜炎診斷中的應用

劉珍瓊，段永和，張齊龍，葉琳，邊澤源

(江西省胸科醫院檢驗科，江西，南昌330006)

結核性胸膜炎是一種常見的肺外病變，表現為淋巴細胞為主的滲出性炎癥，由于該病在臨床上缺乏特異性表現，早期診斷困難，用細菌學方法檢測陽性率低，胸膜活檢因其為創傷性操作限制了在臨床上的廣泛應用，分子生物學雖提供了快速診斷技術，但仍存在假陽性和技術方面的問題。結核桿菌感染T細胞斑點(T-SPOT.TB)技術是目前診斷結核性胸膜炎敏感性較高的細胞學檢測技術[1]。我們應用T-SPOT.TB技術檢測外周血單個核細胞(PBMCs)和胸腔積液單個核細胞(PEMCs)中被結核分枝桿菌早期分泌靶向抗原6(ESAT-6)和培養濾液蛋白10(CFP-10)致敏的T細胞數目，來探討胸腔積液細胞學檢查方法對結核性胸膜炎的診斷及與其它種類胸腔積液的鑒別診斷價值。

1 材料與方法

1.1 標本來源

1.1.1 結核性胸膜炎組 (TBP組)收集2011年12月至2013年2月本院結核內科、胸外科住院病人32例，其中男性18例，女性14例，年齡18～70歲，入選標準符合《結核病診治指南》對結核性胸膜炎的診斷標準。

1.1.2 非結核性胸膜炎組 收集2011年12月至2013年2月本院腫瘤科、呼吸內科、胸外科非結核性胸腔積液病人26例,其中男性17例，女性9例，年齡19～73歲。

1.2 儀器與試劑 青島海爾生物安全柜 (HR40-ⅡA2),CO2培養箱；T-SPOT.TB試劑盒 (英國Oxford Immunotec Ltd)和BD單個核細胞分離器(BD Vacutainer CPT tube)由復星診斷公司提供。

1.3 檢測方法

1.3.1 外周血單個核細胞(PBMCs)的分離、收集 對每位入選患者采集肝素鋰抗凝的外周血5～10ml，加入等體積RPMI 1640細胞培養液混勻后，加在預先準備好的Ficoll淋巴細胞分離液上層，3000 r／min水平離心20 min,用毛細滴管吸取中間層云霧狀細胞，用RPMI 1640培養液洗滌PBMC 2次，進行顯微鏡下細胞計數，根據計數結果用無血清AIM-V培養基調整細胞懸液濃度至2.5×106／ml。

1.3.2 胸腔積液中的單個核細胞(PEMCs)的分離、收集 采集新鮮胸腔積液5～10ml，置肝素鋰抗凝管即刻混勻，其它操作同PBMCs的分離。

1.3.3 檢測過程 在已包被小鼠抗人IFN-γ單克隆抗體的微孔培養板中分別加入作為陰性對照的AIM-V培養基、陽性對照植物血凝素PHA、MTB特異性混合多肽早期分泌靶向抗原6(ESAT-6)與培養濾液蛋白10(CFP-10)各50μl，然后在各孔中加入調整好濃度的細胞懸液100μl。將微孔板放在37℃，5%CO2培養箱中培養 16～20h，用 PBS 緩沖液洗板，加入堿性磷酸酶標記的單克隆抗體50μl，在2～8℃下孵育1h后洗板，最后在每孔中加入底物顯色液，室溫下靜置反應7 min后用蒸餾水終止反應。

1.3.4 T-SPOT.TB試驗結果判讀 根據T-SPOT.TB試劑使用說明書，如果陰性對照孔斑點數(SCF)<6時且 (抗原A或抗原B孔的斑點數)-(陰性對照孔斑點數)≥6，可判斷檢測標本為陽性；如果陰性對照孔斑點數為6～10個時且(抗原A或抗原B孔的斑點數)≥2×(陰性對照孔斑點數)可判斷檢測標本為陽性；如果上述標準不符合且陽性質控對照孔正常時檢測結果為“陰性”。

1.4 統計學方法 采用卡方檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胸腔積液檢測結果 胸腔積液T-SPOT.TB技術檢測結果：TBP組32例患者中30例為陽性，非結核性胸膜炎組26例中1例為陽性，檢測敏感性為93.75%，特異性為96.15%，假陽性率為3.84%(1/26),假陰性率為6.25%(2/30),陽性預測值96.77%，陰性預測值92.59%。

2.2 外周血檢測結果 外周血T-SPOT.TB技術檢測結果：TBP組32例患者中26例為陽性，非結核性胸膜炎組26例中2例為陽性，檢測敏感性為81.25%；特異性為92.30%，假陽性率為7.69%(2/26),假陰性率為18.75%(6/32),陽性預測值92.86%，陰性預測值80%。經統計學分析，χ2=4.43，0.025

3 討論

結核分枝桿菌感染的免疫反應主要是細胞介導。作為細胞介導免疫反應的一部分，T細胞被結核分枝桿菌抗原致敏，當這些抗原再次刺激時，活化的效應T細胞，主要CD4、部分CD8細胞產生抗結核感染免疫中的關鍵性細胞因子干擾素-γ(IFN-γ)[2，3]。 T-SPOT.TB 技術以 ESAT-6 和 CFP-10 作為刺激抗原，刺激外周血單個核細胞(PBMCs)和胸腔積液單個核細胞(PEMCs)，如果機體存在結核感染效應T淋巴細胞，經ESAT-6和CFP-10刺激后,通過體外的細胞培養，刺激底物和效應T淋巴細胞產生大量細胞因子IFN-γ，再通過酶聯免疫斑點技術(ELISPOT)檢測IFN-γ分泌T細胞數目來證實機體存在結核感染。由于ESAT-6和CFP-10這兩種蛋白由結核桿菌的RDl基因序列合成，而該基因序列僅存在于致病性結核桿菌之中，環境中的非典型分枝桿菌和卡介苗中均不含該基因序列[4]，故將上述兩種結核感染的特異性抗原作為刺激物來進行T-SPOT.TB檢測，從理論上保證了TSPOT.TB的高度特異性。另一方面ESAT-6和CFP-10兩種抗原聯合檢測綜合了單一抗原優勢，可針對外周血或胸腔積液單個核細胞上的不同表位進行刺激，產生IFN-γ，具有更強的活化能力，比單一抗原更為靈敏。因此，ESAT-6和CFP-10兩種抗原作為特異性刺激抗原具備更高的檢測敏感性和特異性，從而為臨床癥狀不典型、抗酸染色、結核桿菌培養均呈陰性的疑似結核桿菌感染和隱性結核桿菌感染患者提供有效的診斷方法[5]。

表1 結核性胸膜炎胸腔積液與外周血T-SPOT.TB檢測結果比較

目前國內的研究多采用結核感染患者的外周血進行T-SPOT.TB檢測[6-8]，可是國外有學者認為，結核抗原特異性T細胞具有向病變部位集中的特點，T-SPOT．TB技術的檢測物已不僅局限于外周血，同時也可用于支氣管肺泡灌洗液、痰液、胸腹水、腦脊液等對肺內及肺外結核的診斷[9]。Losi等[10]認為胸腔積液中的單個核細胞比外周血更有診斷價值。本試驗選擇來自病變部位的胸腔積液作為檢測對象，通過T-SPOT.TB技術檢測受感染組織中的T細胞反應因子，能夠提高活動性結核診斷的敏感性和特異性。試驗結果顯示，胸腔積液單個核細胞T-SPOT.TB技術檢測結核性胸膜炎的敏感性為93.75%、特異性96.15%，而外周血單個核細胞敏感性則為81.25%、特異性92.30%。表明受感染組織的T-SPOT.TB技術較單純外周血檢測對診斷活動性結核病敏感性和特異性更高。Lee等[11]對40例胸腔積液患者(其中19例結核性胸膜炎)的胸腔積液和外周血單個核細胞進行T-SPOT.TB檢測,胸腔積液的敏感性和特異性分別為94.7%、85.7%，外周血的敏感性和特異性分別為77.8%、90.5%。本試驗胸腔積液的結果與Lee等的基本一致，外周血的敏感性比Lee等的研究結果要高，但是比國內張瑛等[6]、肖倩等[7]研究結果要低。本試驗TBM組有2例胸腔積液檢測呈陰性反應，分析原因可能是患者經治療后體內的特異性T細胞數目迅速減少而造成的假陰性，對照組出現一例陽性，該患者為肺癌病人，分析其原因可能是患者曾經有過結核分枝桿菌的潛伏性感染，當然也不能排除腫瘤合并結核感染的可能。

綜上所述，外周血和胸腔積液單個核細胞TSPOT.TB技術都可以作為當前診斷結核性胸膜炎的輔助方法，但是胸腔積液單個核細胞T-SPOT.TB技術較外周血具有更好的敏感性和特異性。

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